【摘要】：背景和目的牙周炎是由牙周致病菌引起的牙周組織慢性感染性疾病,是口腔常見病、多發(fā)病,發(fā)病率高達(dá)80%以上。牙周炎會(huì)導(dǎo)致牙周組織結(jié)構(gòu)破壞,牙周附著喪失,繼而形成牙周袋甚至牙齒松動(dòng)、脫落,是導(dǎo)致成年人失牙的主要原因[1]。臨床上牙周炎的治療方法包括牙周基礎(chǔ)治療,同時(shí)配合全身或局部應(yīng)用抗生素治療,以及手術(shù)、修復(fù)治療和支持治療[2]。成骨細(xì)胞導(dǎo)致的骨形成和破骨細(xì)胞引起的骨吸收之間維持著相互耦聯(lián)的動(dòng)態(tài)平衡,骨的形態(tài)因之能保持穩(wěn)定。當(dāng)各種骨吸收刺激因子誘導(dǎo)大量的破骨細(xì)胞活化,導(dǎo)致牙槽骨發(fā)生顯著破壞吸收時(shí),僅僅依靠簡(jiǎn)單的物理和化學(xué)治療很難逆轉(zhuǎn)牙槽骨出現(xiàn)的破壞趨勢(shì)。因此,如果能夠在牙周炎癥的初期抑制破骨細(xì)胞分化成熟、減少牙槽骨的吸收,這對(duì)治療牙周炎、維持患牙功能甚至保留患牙尤為重要。本課題以小鼠RAW264.7細(xì)胞為體外研究模型,研究CORM-3對(duì)RAW264.7這一小鼠源性破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的抑制作用,并探討其作用機(jī)制;并以C57小鼠為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?檢測(cè)CORM-3對(duì)實(shí)驗(yàn)性牙周炎小鼠牙槽骨吸收的抑制作用,以期為牙周炎的臨床治療提供新的思路。RAW264.7細(xì)胞是小鼠源性破骨前體細(xì)胞,該細(xì)胞株最初來源于Abelson小鼠白血病病毒所致的腫瘤。通過RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞獲得成熟破骨細(xì)胞是一種較好的獲取破骨細(xì)胞的方法。曾有多種破骨前體細(xì)胞系(如FDCP、HL-60細(xì)胞、C7細(xì)胞和FLG29.1等)用于破骨細(xì)胞的研究[5],但目前公認(rèn)的唯一成系的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞是RAW264.7[6],該細(xì)胞可表達(dá)破骨細(xì)胞表型標(biāo)志基因,與破骨細(xì)胞的基因表達(dá)譜極其相似,且能形成骨吸收陷窩[7]。RANKL刺激RAW264.7細(xì)胞后,與骨吸收有關(guān)的基因如ca-thepsin K等表達(dá)顯著上調(diào),進(jìn)一步表明RAW264.7細(xì)胞是一種較好的破骨前體細(xì)胞模型。在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞至成熟破骨細(xì)胞的分化過程中有一系列標(biāo)志性基因產(chǎn)生,可作為破骨細(xì)胞及其分化階段的標(biāo)識(shí)。RANKL/RANK/OPG是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化成熟和骨吸收功能的關(guān)鍵系統(tǒng)[8],當(dāng)多種刺激骨吸收因子作用于成骨/基質(zhì)細(xì)胞后,成骨/基質(zhì)細(xì)胞在其表面表達(dá)RANKL特異性的識(shí)別破骨細(xì)胞前體,并與其膜上的功能性受體RANK結(jié)合,刺激破骨細(xì)胞前體發(fā)育成成熟的破骨細(xì)胞。同時(shí)RANKL還能通過RANK途徑,使成熟的破骨細(xì)胞內(nèi)迅速形成肌動(dòng)蛋白環(huán),激活成熟的破骨細(xì)胞發(fā)揮骨吸收功能�？咕剖崴嵝粤姿崦�(TRAP)是在破骨細(xì)胞中高度表達(dá)的關(guān)鍵酶,并參與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨轉(zhuǎn)換過程。組織蛋白酶K(Cathepsin K)是表達(dá)于破骨細(xì)胞上并以溶膠原形式存在的半胱氨酸蛋白酶。Cts-K與TRAP均為鑒定破骨細(xì)胞的重要基因[9]�；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)屬于鋅結(jié)合肽鏈內(nèi)切酶家族。為包括骨組織在內(nèi)的多種組織細(xì)胞外基質(zhì)降解所必須。MMP,尤其是MMP-9在破骨細(xì)胞中高表達(dá),是降解細(xì)胞外基質(zhì)、參與骨重建的重要蛋白酶,在破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)的骨吸收中起重要作用[10]。CORM是近年來新合成的一種CO復(fù)合物,經(jīng)適當(dāng)溶劑溶解后能夠在生理環(huán)境下可控制地釋放CO,可作為外源性CO供源。已有研究證實(shí),CORM能抑制關(guān)節(jié)炎小鼠病變區(qū)內(nèi)多種炎癥分子的表達(dá),有效改善其臨床表征[11]CORM通過其抗氧化、抗炎及抗細(xì)胞凋亡作用,可以減輕脂多糖誘導(dǎo)下的大鼠多器官功能損傷[12]。本課題組在前期研究中已發(fā)現(xiàn)CORM作為外源性CO供源,能夠抑制炎癥因子誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細(xì)胞黏附分子的表達(dá),降低免疫活性細(xì)胞的浸潤(rùn)和黏附[13];同時(shí)還發(fā)現(xiàn)CORM能有效抑制實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠血清中TNF-α和IL-1β的升高,抑制牙槽骨的吸收及病變區(qū)域炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn),證實(shí)CORM能有效抑制大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎的病理進(jìn)程。血紅素氧合酶-1(HO-1)是血紅素降解的限速酶。HO系統(tǒng)是廣泛存在于人和哺乳動(dòng)物體內(nèi)的微粒體酶系統(tǒng)。在正常狀態(tài)下,HO-1呈低水平表達(dá),易受多種因素誘導(dǎo)表達(dá),如血紅素、細(xì)胞因子、CO[14]等。已有研究表明HO-1在骨改建過程中可起到直接的調(diào)節(jié)作用[15,16]。本課題通過培養(yǎng)小鼠RAW264.7細(xì)胞并對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行破骨分化誘導(dǎo),建立體外破骨細(xì)胞分化體系,然后在該體系中加入CORM-3,證實(shí)CORM-3通過HO-1途徑在一定程度上抑制破骨細(xì)胞的分化與成熟。同時(shí)通過建立實(shí)驗(yàn)性牙周炎小鼠模型,經(jīng)腹腔注射CORM-3,發(fā)現(xiàn)CORM-3能夠抑制實(shí)驗(yàn)性牙周炎小鼠牙槽骨內(nèi)破骨細(xì)胞的形成和牙槽骨的吸收。以往對(duì)牙周炎治療的研究多數(shù)針對(duì)控制牙周炎癥方面或聚焦研究成骨方面,本實(shí)驗(yàn)以抑制骨吸收為目標(biāo),從延緩牙周炎牙槽骨吸收進(jìn)程入手,為牙周炎的臨床治療提供了新的思路以及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。方法1.小鼠RAW264.7細(xì)胞破骨分化模型的建立將小鼠RAW264.7細(xì)胞以5×104的密度接種于6孔板,細(xì)胞分為兩組:對(duì)照組和破骨誘導(dǎo)組(100μg/LRANKL+50 μg/LM-CSF),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)5天后,用TRAP染色法檢測(cè)不同組細(xì)胞破骨分化的情況。2.不同濃度CORM-3對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞活性的影響RAW264.7細(xì)胞于0、100、200、400及800μM的CORM-3培養(yǎng)液分別培養(yǎng)24h和48h后,以CCK-8法檢測(cè)不同濃度CORM-3對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響。3.CORM-3抑制RAW264.7細(xì)胞破骨分化將小鼠RAW264.7細(xì)胞以5×104的密度接種于6孔板,細(xì)胞分為三組:對(duì)照組、破骨誘導(dǎo)組(100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF)和CORM-3組(200 μM CORM-3+100μg/LRANKL+50μg/LM-CSF),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)5天后,用TRAP染色法檢測(cè)不同組細(xì)胞破骨分化的情況。4.CORM-3抑制小鼠RAW264.7細(xì)胞破骨分化四種破骨相關(guān)因子(RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K)mRNA和蛋白表達(dá)將小鼠RAW264.7細(xì)胞以5×104細(xì)胞密度接種于6孔板,細(xì)胞分為四組:對(duì)照組、破骨誘導(dǎo)組(100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF)、失活 CORM-3 組(200μM失活 CORM-3+100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF)和 CORM-3 組(200 μM CORM-3+100 μg/LRANKL+50 μg/LM-CSF),每組設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng) 5、7、9天后,用RT-PCR和Western Blot方法分別檢測(cè)細(xì)胞中RANK,TRAP,MMP-9和Cts-K四種破骨相關(guān)因子的mRNA及蛋白表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少三次。5.HO-1基因沉默慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)將小鼠RAW264.7細(xì)胞以5×105細(xì)胞密度接種于12孔板,細(xì)胞分為五組:空白組、NC對(duì)照組、SH-1病毒組、SH-2病毒組和SH-3病毒組,每組均分為三個(gè)MOI值(MOI=40、50、60),感染5天后在熒光顯微鏡下觀察選出最佳感染MOI值;用最佳MOI值組別的細(xì)胞進(jìn)行PT-PCR和Westen Blot方法檢測(cè),篩選出感染效率最高的慢病毒進(jìn)行后續(xù)正式感染實(shí)驗(yàn)。6.HO-1基因沉默后CORM-3對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞破骨分化四種破骨相關(guān)因子(RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K)mRNA和蛋白表達(dá)的影響HO-1基因沉默后的小鼠RAW264.7細(xì)胞以5×104細(xì)胞密度接種于6孔板。細(xì)胞分為4組:對(duì)照組、破骨誘導(dǎo)組(100 μg/LRANKL+50 μg/LM-CSF)、失活 CORM-3 組(200 μM 失活 CORM-3+100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF)和CORM-3 組(200 μM CORM-3+100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF),每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)5、7、9天后,分別用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western Blot方法檢測(cè)細(xì)胞中RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的mRNA及蛋白表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少三次。7.CORM-3抑制實(shí)驗(yàn)性牙周炎小鼠牙槽骨內(nèi)破骨細(xì)胞分化成熟及牙槽骨吸收選擇雄性8周齡C57小鼠36只(23g-25g)。將C57小鼠隨機(jī)分為三組(每組12只),即正常組、慢性牙周炎組(CP組)及CORM-3干預(yù)牙周炎組(CORM-3組)。其中,CP組和CORM-3組采用絲線結(jié)扎上頜第二磨牙同時(shí)局部注射內(nèi)毒素法建立牙周炎模型。CORM-3組和CP組自結(jié)扎當(dāng)天起分別腹腔注射一氧化碳釋放分子-3溶液(CORM-3,10 mg/kg/d)和等體積無菌生理鹽水。分別于牙周結(jié)扎的第7天和第14天,各組分別處死6只小鼠,并制作雙側(cè)上頌骨標(biāo)本。一側(cè)上頜骨標(biāo)本去除附著的牙周軟組織用甲苯胺藍(lán)染色后,在體視顯微鏡下觀察每組牙槽骨吸收情況;另一側(cè)上頜骨標(biāo)本經(jīng)固定、脫鈣、透明、包埋后制作常規(guī)石蠟切片,TRAP染色后顯微鏡下觀察每組牙槽骨內(nèi)破骨細(xì)胞分化成熟的情況。結(jié)果1.小鼠RAW264.7細(xì)胞破骨分化模型的建立RAW264.7細(xì)胞加入破骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)5天后,TRAP染色顯示有明顯破骨細(xì)胞形成,且破骨細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組(P0.05)。2.不同濃度CORM-3對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞活性的影響24h和48hCCK-8檢測(cè)結(jié)果均顯示:1 00μM和200μM的CORM-3均不影響RAW264.7細(xì)胞的活性,且200μM的CORM-3對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖有顯著的促進(jìn)作用,而800μM的CORM-3顯著抑制了RAW264.7細(xì)胞的增殖,(P0.05)。因此選擇濃度為200μM的CORM-3作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作濃度。3.CORM-3抑制RAW264.7細(xì)胞破骨分化RAW264.7細(xì)胞破骨誘導(dǎo)的同時(shí)加入CORM-3,5天后TRAP染色顯示CORM-3干預(yù)組僅有少量破骨細(xì)胞形成,且破骨細(xì)胞數(shù)量顯著低于破骨誘導(dǎo)組(P0.05)。4.CORM-3抑制小鼠RAW264.7細(xì)胞破骨分化四種破骨相關(guān)因子(RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K)mRNA和蛋白表達(dá)RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行破骨誘導(dǎo)后,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)第5、7、9天4種破骨相關(guān)基因RANK,TRAP,MMP-9,Cathepsin K的mRNA表達(dá),結(jié)果顯示,第5、7、9天破骨誘導(dǎo)組中細(xì)胞四種因子mRNA的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P0.05)。CORM-3組中四種因子mRNA的表達(dá)較之破骨誘導(dǎo)組有顯著降低(P0.05)。失活 CORM-3 組中,RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K 的 mRNA表達(dá)比CORM-3組有顯著增強(qiáng)(P0.05),但與破骨誘導(dǎo)組相比無顯著差異(P＞0.05)。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示第5、7、9天破骨誘導(dǎo)組中細(xì)胞RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P0.05)。而CORM-3組中四種因子的蛋白表達(dá)較之破骨誘導(dǎo)組有顯著降低(P0.05)。失活CORM-3組中,RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K 的蛋白表達(dá)顯著高于 CORM-3 組(P0.05),但與破骨誘導(dǎo)組相比無顯著差異(P0.05)。5.HO-1基因沉默慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:SH-3病毒在MOI值為60時(shí)對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞HO-1基因的沉默效率最高。6.HO-1基因沉默后CORM-3對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞破骨分化四種破骨相關(guān)因子(RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K)mRNA和蛋白表達(dá)的影響小鼠RAW264.7細(xì)胞中的HO-1基因沉默后,再進(jìn)行破骨誘導(dǎo),用熒光實(shí)時(shí)定量 PCR 技術(shù)檢測(cè)第 5、7、9 天 RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K 的 mRNA 表達(dá)。結(jié)果顯示,破骨誘導(dǎo)組、失活CORM-3組及CORM-3組四種因子的mRNA表達(dá)均比對(duì)照組有顯著增強(qiáng)(P0.05)。三組間比較,四種因子的mRNA表達(dá)無顯著性差別(P＞0.05)。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示第5、7、9天破骨誘導(dǎo)組、失活CORM-3組及CORM-3組中RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增加(P0.05),而CORM-3組與破骨誘導(dǎo)組相比,四種因子的表達(dá)無顯著性差異(P0.05)。7.CORM-3抑制實(shí)驗(yàn)性牙周炎小鼠牙槽骨內(nèi)破骨細(xì)胞分化成熟及牙槽骨吸收實(shí)驗(yàn)性牙周炎小鼠經(jīng)腹腔注射CORM-3 7天、14天后,小鼠上頜骨甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示,CP組牙槽骨高度顯著低于CORM-3組(P0.05)。上頜骨TRAP染色結(jié)果顯示,CORM-3組牙槽骨內(nèi)成熟破骨細(xì)胞數(shù)量較CP組顯著減少(P0.05)。結(jié)論1.CORM-3能夠抑制RANKL+M-CSF誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化。2.CORM-3能夠顯著降低破骨相關(guān)因子RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的mRNA及蛋白表達(dá)。這一抑制作用是通過CORM-3釋放的CO實(shí)現(xiàn)的。3.將RAW264.7細(xì)胞中HO-1基因沉默后,CORM-3對(duì)破骨誘導(dǎo)過程中RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的mRNA及蛋白表達(dá)的調(diào)控作用喪失,表明CORM-3對(duì)RAW264.7細(xì)胞破骨分化的抑制作用是通過HO-1通路進(jìn)行的。4.CORM-3能夠抑制實(shí)驗(yàn)性牙周炎小鼠牙槽骨內(nèi)破骨細(xì)胞的分化成熟,抑制牙周炎小鼠牙槽骨的吸收。
【圖文】：

ｌｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＳＡ００００１－２），１：６０００，室溫條件下孵育丨小時(shí)；逡逑１０）將ＰＶＤＦ膜置于搖床上，ＴＢＳＴ漂洗３次，每次１０分鐘；逡逑１１）采用ＣｈａｍｐＣｈｅｍＴＮＨｌ學(xué)發(fā)光成像儀（賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，北京，中國(guó)），逡逑Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ化學(xué)發(fā)光試劑（美國(guó)，麻�。╋@影；逡逑１２）邐Ｌａｎｅ邋１Ｄ邋４．０凝膠成像分析軟件進(jìn)行化學(xué)成像和數(shù)據(jù)分析。逡逑２．９數(shù)據(jù)處理逡逑以上實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，應(yīng)用Ｇｒａｐｈｐａｄ邋Ｐｒｉｓｍ邋５邋Ｖ５．０１軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，逡逑采用單因素方差分析（Ｏｎｅ－ｗａｙ邋ＡＮＯＶＡ）方法，戶＜０．０５有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。逡逑結(jié)果逡逑１．小鼠ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞系培養(yǎng)逡逑小鼠ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞的形態(tài)特征逡逑ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞傳代后２小時(shí)貼壁，形態(tài)以類圓形和不規(guī)則多邊形為主，有的有逡逑偽足，一般含１－２個(gè)核，細(xì)胞胞體較小。細(xì)胞生長(zhǎng)快，５－６天可匯合，細(xì)胞貼壁緊。逡逑

ｕ邐２４ｈ邐４８ｈ逡逑圖２不同濃度ＣＯＲＭ－３對(duì)ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞活性的影響逡逑ＯｐＭ、１０0ｍＭ、２００｜ｘＭ、４００ｐＭ、８０0ｍＭＣＯＲＭ－３分別培養(yǎng)小鼠ＲＡＷ２６４．７逡逑細(xì)胞２４小時(shí)和４８小時(shí)，以ＣＣＫ－８法測(cè)定４５０ｎｍ波長(zhǎng)處的ＯＤ值，檢測(cè)各組細(xì)胞的逡逑增殖情況，以ＣＯＲＭ－３濃度為ＯｐＭ組為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組ｖｓ．對(duì)照組＊Ｐ＜０．０５。逡逑３．小鼠ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞破骨誘導(dǎo)后ＴＲＡＰ染色結(jié)果逡逑小鼠ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞經(jīng)邋１００邋ｎｇ／Ｌ邋ＲＡＮＫＬ＋５０邋ｐｇ／Ｌ邋Ｍ－ＣＳＦ破骨誘導(dǎo)５天后，逡逑ＴＲＡＰ染色顯示，破骨誘導(dǎo)組有大量多核破骨細(xì)胞形成，而對(duì)照組未見破骨細(xì)胞逡逑形成。每組內(nèi)每張切片隨機(jī)挑選３個(gè)視野進(jìn)行拍照（２００倍視野），拍照時(shí)盡量讓逡逑組織充滿整個(gè)視野，保證每張照片的背景光一致。應(yīng)用Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ邋Ｐｌｕｓ邋６．０軟件選逡逑取紅染多核細(xì)胞為破骨細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。以２００倍標(biāo)尺為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算組織面積，求逡逑出每平方毫米破骨細(xì)胞的數(shù)量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示破骨誘導(dǎo)組破骨細(xì)胞數(shù)量顯著高于逡逑對(duì)照組（＊尸＜０．０５）（圖３）。逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R781.42

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本文編號(hào)：2671801