【摘要】：背景和目的牙周炎是由牙周致病菌引起的牙周組織慢性感染性疾病,是口腔常見病、多發(fā)病,發(fā)病率高達80%以上。牙周炎會導致牙周組織結構破壞,牙周附著喪失,繼而形成牙周袋甚至牙齒松動、脫落,是導致成年人失牙的主要原因[1]。臨床上牙周炎的治療方法包括牙周基礎治療,同時配合全身或局部應用抗生素治療,以及手術、修復治療和支持治療[2]。成骨細胞導致的骨形成和破骨細胞引起的骨吸收之間維持著相互耦聯(lián)的動態(tài)平衡,骨的形態(tài)因之能保持穩(wěn)定。當各種骨吸收刺激因子誘導大量的破骨細胞活化,導致牙槽骨發(fā)生顯著破壞吸收時,僅僅依靠簡單的物理和化學治療很難逆轉(zhuǎn)牙槽骨出現(xiàn)的破壞趨勢。因此,如果能夠在牙周炎癥的初期抑制破骨細胞分化成熟、減少牙槽骨的吸收,這對治療牙周炎、維持患牙功能甚至保留患牙尤為重要。本課題以小鼠RAW264.7細胞為體外研究模型,研究CORM-3對RAW264.7這一小鼠源性破骨前體細胞向破骨細胞分化的抑制作用,并探討其作用機制;并以C57小鼠為體內(nèi)實驗模型,檢測CORM-3對實驗性牙周炎小鼠牙槽骨吸收的抑制作用,以期為牙周炎的臨床治療提供新的思路。RAW264.7細胞是小鼠源性破骨前體細胞,該細胞株最初來源于Abelson小鼠白血病病毒所致的腫瘤。通過RANKL誘導RAW264.7細胞獲得成熟破骨細胞是一種較好的獲取破骨細胞的方法。曾有多種破骨前體細胞系(如FDCP、HL-60細胞、C7細胞和FLG29.1等)用于破骨細胞的研究[5],但目前公認的唯一成系的破骨細胞前體細胞是RAW264.7[6],該細胞可表達破骨細胞表型標志基因,與破骨細胞的基因表達譜極其相似,且能形成骨吸收陷窩[7]。RANKL刺激RAW264.7細胞后,與骨吸收有關的基因如ca-thepsin K等表達顯著上調(diào),進一步表明RAW264.7細胞是一種較好的破骨前體細胞模型。在破骨細胞前體細胞至成熟破骨細胞的分化過程中有一系列標志性基因產(chǎn)生,可作為破骨細胞及其分化階段的標識。RANKL/RANK/OPG是調(diào)節(jié)破骨細胞分化成熟和骨吸收功能的關鍵系統(tǒng)[8],當多種刺激骨吸收因子作用于成骨/基質(zhì)細胞后,成骨/基質(zhì)細胞在其表面表達RANKL特異性的識別破骨細胞前體,并與其膜上的功能性受體RANK結合,刺激破骨細胞前體發(fā)育成成熟的破骨細胞。同時RANKL還能通過RANK途徑,使成熟的破骨細胞內(nèi)迅速形成肌動蛋白環(huán),激活成熟的破骨細胞發(fā)揮骨吸收功能�？咕剖崴嵝粤姿崦�(TRAP)是在破骨細胞中高度表達的關鍵酶,并參與破骨細胞介導的骨轉(zhuǎn)換過程。組織蛋白酶K(Cathepsin K)是表達于破骨細胞上并以溶膠原形式存在的半胱氨酸蛋白酶。Cts-K與TRAP均為鑒定破骨細胞的重要基因[9]�；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)屬于鋅結合肽鏈內(nèi)切酶家族。為包括骨組織在內(nèi)的多種組織細胞外基質(zhì)降解所必須。MMP,尤其是MMP-9在破骨細胞中高表達,是降解細胞外基質(zhì)、參與骨重建的重要蛋白酶,在破骨細胞活性增強的骨吸收中起重要作用[10]。CORM是近年來新合成的一種CO復合物,經(jīng)適當溶劑溶解后能夠在生理環(huán)境下可控制地釋放CO,可作為外源性CO供源。已有研究證實,CORM能抑制關節(jié)炎小鼠病變區(qū)內(nèi)多種炎癥分子的表達,有效改善其臨床表征[11]CORM通過其抗氧化、抗炎及抗細胞凋亡作用,可以減輕脂多糖誘導下的大鼠多器官功能損傷[12]。本課題組在前期研究中已發(fā)現(xiàn)CORM作為外源性CO供源,能夠抑制炎癥因子誘導的人牙齦成纖維細胞黏附分子的表達,降低免疫活性細胞的浸潤和黏附[13];同時還發(fā)現(xiàn)CORM能有效抑制實驗性牙周炎大鼠血清中TNF-α和IL-1β的升高,抑制牙槽骨的吸收及病變區(qū)域炎癥細胞的浸潤,證實CORM能有效抑制大鼠實驗性牙周炎的病理進程。血紅素氧合酶-1(HO-1)是血紅素降解的限速酶。HO系統(tǒng)是廣泛存在于人和哺乳動物體內(nèi)的微粒體酶系統(tǒng)。在正常狀態(tài)下,HO-1呈低水平表達,易受多種因素誘導表達,如血紅素、細胞因子、CO[14]等。已有研究表明HO-1在骨改建過程中可起到直接的調(diào)節(jié)作用[15,16]。本課題通過培養(yǎng)小鼠RAW264.7細胞并對該細胞進行破骨分化誘導,建立體外破骨細胞分化體系,然后在該體系中加入CORM-3,證實CORM-3通過HO-1途徑在一定程度上抑制破骨細胞的分化與成熟。同時通過建立實驗性牙周炎小鼠模型,經(jīng)腹腔注射CORM-3,發(fā)現(xiàn)CORM-3能夠抑制實驗性牙周炎小鼠牙槽骨內(nèi)破骨細胞的形成和牙槽骨的吸收。以往對牙周炎治療的研究多數(shù)針對控制牙周炎癥方面或聚焦研究成骨方面,本實驗以抑制骨吸收為目標,從延緩牙周炎牙槽骨吸收進程入手,為牙周炎的臨床治療提供了新的思路以及實驗基礎和理論依據(jù)。方法1.小鼠RAW264.7細胞破骨分化模型的建立將小鼠RAW264.7細胞以5×104的密度接種于6孔板,細胞分為兩組:對照組和破骨誘導組(100μg/LRANKL+50 μg/LM-CSF),每組設3個復孔。培養(yǎng)5天后,用TRAP染色法檢測不同組細胞破骨分化的情況。2.不同濃度CORM-3對小鼠RAW264.7細胞活性的影響RAW264.7細胞于0、100、200、400及800μM的CORM-3培養(yǎng)液分別培養(yǎng)24h和48h后,以CCK-8法檢測不同濃度CORM-3對RAW264.7細胞活性的影響。3.CORM-3抑制RAW264.7細胞破骨分化將小鼠RAW264.7細胞以5×104的密度接種于6孔板,細胞分為三組:對照組、破骨誘導組(100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF)和CORM-3組(200 μM CORM-3+100μg/LRANKL+50μg/LM-CSF),每組設3個復孔。培養(yǎng)5天后,用TRAP染色法檢測不同組細胞破骨分化的情況。4.CORM-3抑制小鼠RAW264.7細胞破骨分化四種破骨相關因子(RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K)mRNA和蛋白表達將小鼠RAW264.7細胞以5×104細胞密度接種于6孔板,細胞分為四組:對照組、破骨誘導組(100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF)、失活 CORM-3 組(200μM失活 CORM-3+100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF)和 CORM-3 組(200 μM CORM-3+100 μg/LRANKL+50 μg/LM-CSF),每組設 3 個復孔。細胞培養(yǎng) 5、7、9天后,用RT-PCR和Western Blot方法分別檢測細胞中RANK,TRAP,MMP-9和Cts-K四種破骨相關因子的mRNA及蛋白表達。上述實驗均重復至少三次。5.HO-1基因沉默慢病毒轉(zhuǎn)染實驗將小鼠RAW264.7細胞以5×105細胞密度接種于12孔板,細胞分為五組:空白組、NC對照組、SH-1病毒組、SH-2病毒組和SH-3病毒組,每組均分為三個MOI值(MOI=40、50、60),感染5天后在熒光顯微鏡下觀察選出最佳感染MOI值;用最佳MOI值組別的細胞進行PT-PCR和Westen Blot方法檢測,篩選出感染效率最高的慢病毒進行后續(xù)正式感染實驗。6.HO-1基因沉默后CORM-3對小鼠RAW264.7細胞破骨分化四種破骨相關因子(RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K)mRNA和蛋白表達的影響HO-1基因沉默后的小鼠RAW264.7細胞以5×104細胞密度接種于6孔板。細胞分為4組:對照組、破骨誘導組(100 μg/LRANKL+50 μg/LM-CSF)、失活 CORM-3 組(200 μM 失活 CORM-3+100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF)和CORM-3 組(200 μM CORM-3+100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF),每組設三個復孔。細胞培養(yǎng)5、7、9天后,分別用實時熒光定量PCR及Western Blot方法檢測細胞中RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的mRNA及蛋白表達。上述實驗均重復至少三次。7.CORM-3抑制實驗性牙周炎小鼠牙槽骨內(nèi)破骨細胞分化成熟及牙槽骨吸收選擇雄性8周齡C57小鼠36只(23g-25g)。將C57小鼠隨機分為三組(每組12只),即正常組、慢性牙周炎組(CP組)及CORM-3干預牙周炎組(CORM-3組)。其中,CP組和CORM-3組采用絲線結扎上頜第二磨牙同時局部注射內(nèi)毒素法建立牙周炎模型。CORM-3組和CP組自結扎當天起分別腹腔注射一氧化碳釋放分子-3溶液(CORM-3,10 mg/kg/d)和等體積無菌生理鹽水。分別于牙周結扎的第7天和第14天,各組分別處死6只小鼠,并制作雙側(cè)上頌骨標本。一側(cè)上頜骨標本去除附著的牙周軟組織用甲苯胺藍染色后,在體視顯微鏡下觀察每組牙槽骨吸收情況;另一側(cè)上頜骨標本經(jīng)固定、脫鈣、透明、包埋后制作常規(guī)石蠟切片,TRAP染色后顯微鏡下觀察每組牙槽骨內(nèi)破骨細胞分化成熟的情況。結果1.小鼠RAW264.7細胞破骨分化模型的建立RAW264.7細胞加入破骨誘導液誘導5天后,TRAP染色顯示有明顯破骨細胞形成,且破骨細胞數(shù)量顯著高于對照組(P0.05)。2.不同濃度CORM-3對小鼠RAW264.7細胞活性的影響24h和48hCCK-8檢測結果均顯示:1 00μM和200μM的CORM-3均不影響RAW264.7細胞的活性,且200μM的CORM-3對RAW264.7細胞增殖有顯著的促進作用,而800μM的CORM-3顯著抑制了RAW264.7細胞的增殖,(P0.05)。因此選擇濃度為200μM的CORM-3作為后續(xù)實驗操作濃度。3.CORM-3抑制RAW264.7細胞破骨分化RAW264.7細胞破骨誘導的同時加入CORM-3,5天后TRAP染色顯示CORM-3干預組僅有少量破骨細胞形成,且破骨細胞數(shù)量顯著低于破骨誘導組(P0.05)。4.CORM-3抑制小鼠RAW264.7細胞破骨分化四種破骨相關因子(RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K)mRNA和蛋白表達RAW264.7細胞進行破骨誘導后,用實時熒光定量PCR技術檢測第5、7、9天4種破骨相關基因RANK,TRAP,MMP-9,Cathepsin K的mRNA表達,結果顯示,第5、7、9天破骨誘導組中細胞四種因子mRNA的表達均顯著高于對照組(P0.05)。CORM-3組中四種因子mRNA的表達較之破骨誘導組有顯著降低(P0.05)。失活 CORM-3 組中,RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K 的 mRNA表達比CORM-3組有顯著增強(P0.05),但與破骨誘導組相比無顯著差異(P＞0.05)。Western Blot檢測結果顯示第5、7、9天破骨誘導組中細胞RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的蛋白表達均顯著高于對照組(P0.05)。而CORM-3組中四種因子的蛋白表達較之破骨誘導組有顯著降低(P0.05)。失活CORM-3組中,RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K 的蛋白表達顯著高于 CORM-3 組(P0.05),但與破骨誘導組相比無顯著差異(P0.05)。5.HO-1基因沉默慢病毒轉(zhuǎn)染實驗實驗結果顯示:SH-3病毒在MOI值為60時對小鼠RAW264.7細胞HO-1基因的沉默效率最高。6.HO-1基因沉默后CORM-3對小鼠RAW264.7細胞破骨分化四種破骨相關因子(RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K)mRNA和蛋白表達的影響小鼠RAW264.7細胞中的HO-1基因沉默后,再進行破骨誘導,用熒光實時定量 PCR 技術檢測第 5、7、9 天 RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K 的 mRNA 表達。結果顯示,破骨誘導組、失活CORM-3組及CORM-3組四種因子的mRNA表達均比對照組有顯著增強(P0.05)。三組間比較,四種因子的mRNA表達無顯著性差別(P＞0.05)。Western Blot檢測結果顯示第5、7、9天破骨誘導組、失活CORM-3組及CORM-3組中RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的蛋白表達較對照組顯著增加(P0.05),而CORM-3組與破骨誘導組相比,四種因子的表達無顯著性差異(P0.05)。7.CORM-3抑制實驗性牙周炎小鼠牙槽骨內(nèi)破骨細胞分化成熟及牙槽骨吸收實驗性牙周炎小鼠經(jīng)腹腔注射CORM-3 7天、14天后,小鼠上頜骨甲苯胺藍染色結果顯示,CP組牙槽骨高度顯著低于CORM-3組(P0.05)。上頜骨TRAP染色結果顯示,CORM-3組牙槽骨內(nèi)成熟破骨細胞數(shù)量較CP組顯著減少(P0.05)。結論1.CORM-3能夠抑制RANKL+M-CSF誘導的小鼠RAW264.7細胞向破骨細胞分化。2.CORM-3能夠顯著降低破骨相關因子RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的mRNA及蛋白表達。這一抑制作用是通過CORM-3釋放的CO實現(xiàn)的。3.將RAW264.7細胞中HO-1基因沉默后,CORM-3對破骨誘導過程中RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的mRNA及蛋白表達的調(diào)控作用喪失,表明CORM-3對RAW264.7細胞破骨分化的抑制作用是通過HO-1通路進行的。4.CORM-3能夠抑制實驗性牙周炎小鼠牙槽骨內(nèi)破骨細胞的分化成熟,抑制牙周炎小鼠牙槽骨的吸收。
【圖文】：

ｌｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＳＡ００００１－２），１：６０００，室溫條件下孵育丨小時；逡逑１０）將ＰＶＤＦ膜置于搖床上，ＴＢＳＴ漂洗３次，每次１０分鐘；逡逑１１）采用ＣｈａｍｐＣｈｅｍＴＮＨｌ學發(fā)光成像儀（賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，北京，中國），逡逑Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ化學發(fā)光試劑（美國，麻�。╋@影；逡逑１２）邐Ｌａｎｅ邋１Ｄ邋４．０凝膠成像分析軟件進行化學成像和數(shù)據(jù)分析。逡逑２．９數(shù)據(jù)處理逡逑以上實驗至少重復三次，應用Ｇｒａｐｈｐａｄ邋Ｐｒｉｓｍ邋５邋Ｖ５．０１軟件進行統(tǒng)計學分析，逡逑采用單因素方差分析（Ｏｎｅ－ｗａｙ邋ＡＮＯＶＡ）方法，戶＜０．０５有統(tǒng)計學意義。逡逑結果逡逑１．小鼠ＲＡＷ２６４．７細胞系培養(yǎng)逡逑小鼠ＲＡＷ２６４．７細胞的形態(tài)特征逡逑ＲＡＷ２６４．７細胞傳代后２小時貼壁，形態(tài)以類圓形和不規(guī)則多邊形為主，有的有逡逑偽足，一般含１－２個核，細胞胞體較小。細胞生長快，５－６天可匯合，細胞貼壁緊。逡逑

ｕ邐２４ｈ邐４８ｈ逡逑圖２不同濃度ＣＯＲＭ－３對ＲＡＷ２６４．７細胞活性的影響逡逑ＯｐＭ、１０0ｍＭ、２００｜ｘＭ、４００ｐＭ、８０0ｍＭＣＯＲＭ－３分別培養(yǎng)小鼠ＲＡＷ２６４．７逡逑細胞２４小時和４８小時，以ＣＣＫ－８法測定４５０ｎｍ波長處的ＯＤ值，檢測各組細胞的逡逑增殖情況，以ＣＯＲＭ－３濃度為ＯｐＭ組為對照組，實驗組ｖｓ．對照組＊Ｐ＜０．０５。逡逑３．小鼠ＲＡＷ２６４．７細胞破骨誘導后ＴＲＡＰ染色結果逡逑小鼠ＲＡＷ２６４．７細胞經(jīng)邋１００邋ｎｇ／Ｌ邋ＲＡＮＫＬ＋５０邋ｐｇ／Ｌ邋Ｍ－ＣＳＦ破骨誘導５天后，逡逑ＴＲＡＰ染色顯示，破骨誘導組有大量多核破骨細胞形成，而對照組未見破骨細胞逡逑形成。每組內(nèi)每張切片隨機挑選３個視野進行拍照（２００倍視野），拍照時盡量讓逡逑組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。應用Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ邋Ｐｌｕｓ邋６．０軟件選逡逑取紅染多核細胞為破骨細胞進行計數(shù)。以２００倍標尺為標準，計算組織面積，求逡逑出每平方毫米破骨細胞的數(shù)量，統(tǒng)計結果顯示破骨誘導組破骨細胞數(shù)量顯著高于逡逑對照組（＊尸＜０．０５）（圖３）。逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R781.42

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1 仲建春;杜q，

本文編號：2671801