【摘要】： 目的 探討在老年骨再生功能低下時(shí)應(yīng)用膜引導(dǎo)結(jié)合Adv-BMP-2局部基因治療對(duì)骨缺損修復(fù)的促進(jìn)作用,以尋找治療老年性骨缺損的有效方法。 1.成骨細(xì)胞的提取、體外培養(yǎng)和鑒定;Adv-BMP-2的擴(kuò)增、純化、滴度測(cè)定;Adv-BMP-2對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。 2.TNF-α對(duì)于成骨細(xì)胞生長的影響和對(duì)BMP受體表達(dá)的調(diào)控作用。 3.手術(shù)建立大鼠去勢(shì)后骨質(zhì)疏松牙槽骨缺損動(dòng)物模型,為進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 4.應(yīng)用體外法(ex vivo)進(jìn)行BMP-2基因轉(zhuǎn)移,研究Adv-BMP-2對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠牙槽骨缺損修復(fù)的成骨效果。 5.異體冷凍骨膜與e-PTFE膜復(fù)合紅骨髓對(duì)頜骨缺損成骨性能的比較分析。 6.通過老年大鼠骨質(zhì)疏松骨缺損動(dòng)物模型,采用體內(nèi)法(in vivo)進(jìn)行BMP-2基因轉(zhuǎn)移結(jié)合膜引導(dǎo)修復(fù)老年性骨缺損并與其他不同植骨材料進(jìn)行比較,以尋找治療老年性骨缺損的有效方法。 方法 1.成骨細(xì)胞的提取、體外培養(yǎng)和鑒定。原代成骨細(xì)胞來自出生1周Wistar乳鼠,進(jìn)行成骨細(xì)胞培養(yǎng),通過形態(tài)學(xué)觀察、ALP染色、體外礦化實(shí)驗(yàn),鑒定成骨細(xì)胞是否培養(yǎng)成功。Adv-BMP-2的擴(kuò)增、純化、滴度測(cè)定。觀察成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染Adv-BMP-2后生物學(xué)行為的變化。 2.采用MTT及PNPP法檢測(cè)不同濃度TNF-α對(duì)于成骨細(xì)胞增殖和分化的影響。在保證細(xì)胞量相等的前提下,利用RT-PCR技術(shù)測(cè)定不同濃度TNF-α對(duì)于成骨細(xì)胞BMP受體表達(dá)的調(diào)控作用。 3.建立大鼠骨質(zhì)疏松牙槽骨缺損動(dòng)物模型并通過各種檢測(cè)方法證實(shí)模型建立。40只3月齡雌性大鼠隨機(jī)分為4組,A組:S0組;B組:0VX組;C組:BD組;D組:0VX+BD組。術(shù)后8周、12周測(cè)定大鼠體重變化;血清中ALP、Ca、P含量及子宮重量系數(shù)變化;用雙能X線吸收法(DEXA)行頜骨密度和骨礦含量測(cè)定。 4.20只健康雌性Wistar大鼠,隨機(jī)分為2組。實(shí)驗(yàn)組:A組為Adv-BMP-2轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞/CS組(A/C組);對(duì)照組:B組為去勢(shì)牙槽骨缺損對(duì)照組(OB組)。分別在第8周、第12周處死動(dòng)物,獲取標(biāo)本并行大體觀察、X線檢查、組織學(xué)檢查。 5.將健康Wistar大鼠斷頸法處死后取顱骨頂骨骨膜制備異體冷凍骨膜(variant deepfreeze periosteum,VDP)備用。24只成年Wistar大鼠隨機(jī)分為3組。于下頜骨升支部制造約0.5cm×0.5cm的骨缺損。A組:SO組:B組:e-PTFE/RBM組;C組:VDP/RBM組。分別在第4周、第8周處死動(dòng)物,獲取標(biāo)本行大體觀察、X線檢查、組織學(xué)檢查。觀察不同膜引導(dǎo)成骨性能的效果。 6.40只雌性,老年Wistar大鼠22月齡(體重330±32g),SPF級(jí)(無特定病原體動(dòng)物),隨機(jī)將40只Wistar大鼠分為ABCDE五組:A組為SO組;B組為VDP/Adv-BMP-2/CS組;C組為VDP/Perioglas組;D組為VDP/HPPA組;E組為VDP/Adv- GFP/CS組。于下頜骨升支部制造約0.5cm×0.5cm的的全厚下頜骨缺損模型,BCD實(shí)驗(yàn)各組分別植入不同材料。A組為對(duì)照組未植入任何材料,作為空白對(duì)照。分別于術(shù)后第8周、第12周處死動(dòng)物。獲取標(biāo)本并行大體觀察、X線檢查、組織學(xué)檢查、免疫組化檢查。E組行體內(nèi)綠色熒光蛋白成骨示蹤,觀察各組不同時(shí)期的新生骨量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。 結(jié)果 1.成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)形態(tài)觀察:成骨細(xì)胞初期為多角形,胞核呈橢圓形;培養(yǎng)1周,細(xì)胞為近立方狀,體積小、核圓。堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè):ALP活性是成骨細(xì)胞分化成熟的重要標(biāo)志之一。體外培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞ALP染色和鈣化實(shí)驗(yàn)均為陽性,證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞具有典型的成熟成骨細(xì)胞的特征。Adv-BMP-2轉(zhuǎn)染后可提高成骨細(xì)胞增殖功能和分化功能。 2.本結(jié)果顯示當(dāng)TNF-α濃度大于50ng/ml時(shí)對(duì)于成骨細(xì)胞增殖就有明顯的抑制作用。當(dāng)TNF-α的濃度大于5ng/ml時(shí)對(duì)于成骨細(xì)胞分化有明顯抑制作用。不同濃度TNF-α均可以抑制BMP-IA和BMPR-Ⅱ基因的表達(dá),但對(duì)BMP-IB卻有促進(jìn)作用。 3.通過手術(shù)建立動(dòng)物模型并進(jìn)行各種指標(biāo)監(jiān)測(cè)顯示,手術(shù)后12周已成功地制備了大鼠骨質(zhì)疏松牙槽骨缺損動(dòng)物模型。為進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。 4.應(yīng)用體外法(ex vivo)進(jìn)行BMP-2基因轉(zhuǎn)移,并進(jìn)行大體觀察、X線檢查和組織學(xué)檢查后發(fā)現(xiàn):Adv-BMP-2對(duì)于骨質(zhì)疏松大鼠牙槽骨缺損修復(fù)有明顯的促進(jìn)作用。 5.VDP及e-PTFE不同引導(dǎo)膜修復(fù)大鼠下頜骨缺損并與空白對(duì)照組比較。術(shù)后8周結(jié)果顯示:VDP及e-PTFE膜組都有新骨形成并遍布整個(gè)骨缺損區(qū)。而對(duì)照組顯示:除邊緣有少量骨組織外骨缺損區(qū)充滿纖維結(jié)締組織。VDP及e-PTFE膜都可引導(dǎo)骨缺損形成骨組織。 6.采用體內(nèi)法(in vivo)進(jìn)行BMP-2基因轉(zhuǎn)移結(jié)合膜引導(dǎo)修復(fù)老年性骨缺損并與其他不同植骨材料進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同種類的生物材料直接影響界面區(qū)早期的組織反應(yīng),膜引導(dǎo)結(jié)合Adv-BMP-2比其它材料較早地引導(dǎo)了新骨形成。 6.1.X線觀察:術(shù)后8周對(duì)照A組骨缺損區(qū)界線清楚,缺損邊緣可見少量高密度影。實(shí)驗(yàn)B組、C組、D組骨缺損區(qū)域均有呈絮狀或云霧狀密度增高影,材料與骨界限清楚,各組差異不明顯。術(shù)后12周:對(duì)照組仍有約2mm左右的骨缺損。B組缺損修復(fù)區(qū)骨密度最高,新生骨組織覆蓋缺損,缺損處密度與周圍骨質(zhì)基本相似,交界已模糊不清。C組、D組缺損也己完全修復(fù),交界線也模糊不清,但缺損處密度略低于周圍骨組織。 6.2.組織學(xué)觀察:術(shù)后8周對(duì)照A組骨缺損區(qū)周邊可見成骨細(xì)胞及少量成骨,骨缺損中心區(qū)可見大量纖維結(jié)締組織形成。實(shí)驗(yàn)B組、C組、D組有不同程度成骨。B組移植骨周邊誘導(dǎo)骨明顯增加,成骨細(xì)胞增生活躍;新骨自四周向中心堆積,鈣鹽沉積增多。C組可見部分區(qū)域Perioglas白色透明顆粒樣成骨材料基本溶解,周圍留下一些顆粒溶解的空腔,在其周圍形成許多基骨。僅少部分材料周圍有薄層的結(jié)締組織,在顆粒間隙可見有明顯的骨母細(xì)胞、骨細(xì)胞、骨樣組織。D組所有材料周圍均有大量類骨質(zhì)生成,但類骨質(zhì)的鈣化程度以及基質(zhì)中細(xì)胞形態(tài)都有差異。材料已牢固地與骨組織連成一片,新骨組織包繞材料,新生骨改建明顯。術(shù)后12周對(duì)照A組骨缺損區(qū)邊緣有少量新骨沉積,腔內(nèi)被纖維組織充滿。成骨細(xì)胞和類骨質(zhì)仍局限在兩端,缺損中央被纖維結(jié)締組織充填,血管少,未見成骨現(xiàn)象。B組缺損處幾乎被新生骨組織充填,僅存少許纖維組織,周邊可見骨小梁形成。C組白骨缺損中心到邊緣區(qū)域的新生骨均由骨橋連結(jié)起來,Perioglas降解后留下的空腔已完全被新生骨取代。骨缺損部位骨樣組織、骨組織進(jìn)一步增多。D組HPPA植入后材料基本由骨組織覆蓋,新骨形成明顯,鈣化程度高,晶界模糊。 6.3.統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果:術(shù)后8周B組優(yōu)于C組(P＜0.05)和D組(P＜0.05);C組與D組兩組差異無顯著性意義(P＞0.05)。術(shù)后12周B組、C組、D組明顯優(yōu)于A組(P＜0.01)。 6.4.大鼠體內(nèi)綠色熒光蛋白成骨示蹤:E組移植術(shù)后2周冰凍切片和連續(xù)石蠟切片,在熒光顯微鏡下觀察,均可見移植部位呈發(fā)射綠色熒光的網(wǎng)狀支架材料并可見成骨細(xì)胞。移植后4周冰凍切片和連續(xù)石蠟切片,在熒光顯微鏡下觀察,仍可見移植部位呈發(fā)射綠色熒光的網(wǎng)狀支架材料及成骨細(xì)胞。 結(jié)論 1.體外實(shí)驗(yàn)證實(shí):Adv-BMP2對(duì)成骨細(xì)胞增殖功能和分化功能有明顯促進(jìn)作用。為后續(xù)BMP-2基因治療的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。 2.當(dāng)TNF-α濃度大于50ng/ml時(shí)對(duì)于成骨細(xì)胞增殖就有明顯的抑制作用。當(dāng)TNF-α的濃度大于5ng/ml時(shí)對(duì)于成骨細(xì)胞分化有明顯抑制作用。不同濃度TNF-α均可以抑制BMP-IA和BMPR-Ⅱ基因的表達(dá),但對(duì)BMP-IB卻有促進(jìn)作用。總體說來,TNF-α對(duì)于BMPR復(fù)合體起抑制作用。 3.可以手術(shù)制備大鼠骨質(zhì)疏松牙槽骨缺損動(dòng)物模型,為進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 4.體外法(ex vivo)進(jìn)行BMP-2基因轉(zhuǎn)移修復(fù)骨質(zhì)疏松牙槽骨缺損,Adv-BMP-2對(duì)于骨質(zhì)疏松大鼠牙槽骨缺損修復(fù)有明顯的促進(jìn)作用。 5.VDP及e-PTFE不同引導(dǎo)膜都可引導(dǎo)大鼠頜骨缺損骨組織修復(fù)。 6.體內(nèi)法(in vivo)進(jìn)行BMP-2基因轉(zhuǎn)移結(jié)合膜引導(dǎo)修復(fù)老年大鼠骨缺損比其它材料較早地引導(dǎo)了新骨形成,是一種理想的骨組織替代材料。特別是對(duì)老年骨再生能力低下骨缺損的修復(fù)有明顯的促進(jìn)作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R782

【引證文獻(xiàn)】

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1 茹嘉;李強(qiáng);;最新進(jìn)展的轉(zhuǎn)基因技術(shù)在骨與軟骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用[J];中國組織工程研究;2013年02期

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本文編號(hào)：2671601