【摘要】：目的:采用高通量測(cè)序技術(shù)分析重度慢性牙周炎齦下菌斑微生物群落與局部牙齦組織中TCRβ鏈CDR3組庫(kù)的特征,探討重度慢性牙周炎與牙周健康的牙齦組織中TCRβ鏈CDR3組庫(kù)的異質(zhì)性,并初步探索齦下菌斑微生物群落構(gòu)成對(duì)局部牙齦組織中TCRβ鏈CDR3組庫(kù)的影響,為進(jìn)一步研究T細(xì)胞在牙周炎發(fā)病機(jī)制中的作用提供新的研究思路與參考。方法:1.收集牙周健康(H組)及重度慢性牙周炎(P組)病例各5例,術(shù)前分別采集1個(gè)擬拔牙位點(diǎn)的齦下菌斑,并采集該牙位的牙齦組織,液氮速凍。2.分別提取各牙齦組織樣本DNA。3.基因組DNA樣本及齦下菌斑樣本送華大基因公司進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建并完成測(cè)序。4.將所得原始數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換整理后,上傳至IMGT/High V-Quest系統(tǒng),分析各樣本TCRβ鏈CDR3組庫(kù)序列的組成,并采用EXCEL軟件、Graph Pad Prism 6軟件、Draw Venn Diagram在線軟件等分析牙周健康及重度慢性牙周炎牙齦組織TCRβ鏈CDR3組庫(kù)中TRBV、TRBJ、V-J配對(duì)的基因取用,CDR3組庫(kù)的多樣性、氨基酸長(zhǎng)度、氨基酸取用及核苷酸的剪切/插入等。5.初步探索齦下微生物組成的差異對(duì)牙齦組織TCRβ鏈CDR3組庫(kù)構(gòu)成的影響。結(jié)果:1.H組、P組患者齦下菌斑中微生物基因組測(cè)序利用OUT韋恩圖分析,結(jié)果顯示,兩組共同定植的核心物種數(shù)目較多。而物種多樣性的分析顯示,P組OUT Rank曲線較H組橫軸窄,下降趨勢(shì)陡,提示P組齦下菌群物種豐富程度及均勻程度較H組低。2.H、P兩組齦下菌斑在門(mén)水平上的統(tǒng)計(jì)分析顯示:H組中放線菌門(mén)與變形桿菌門(mén)顯著高于P組(P0.05),而柔膜菌門(mén)在P組中顯著高于H組(P0.05),且P組中擬桿菌門(mén)、螺旋體門(mén)、互養(yǎng)菌門(mén)均明顯高于H組。在屬水平上,P組中Bulleidia、丁酸弧菌屬、產(chǎn)線菌屬、坦納菌屬顯著高于H組(P0.05)。種水平上的分析顯示,H組中Acinetobacter guillouiae、黃褐二氧化碳嗜纖維菌、羅氏菌、嬰兒鏈球菌顯著高于P組(P0.05),P組中牙髓卟啉單胞菌、中間普雷沃菌顯著高于H組(P0.05)。3.各牙齦組織樣本中TCRβ鏈CDR3組庫(kù)的功能性獨(dú)特序列與功能性總序列的比值分別為:H1:12.15%,H2:12.49%,H3:11.85%,H4:11.39%,H5:11.94%,P1:11.46%,P2:11.39%,P3:8.43%,P4:8.14%,P5:11.57%。H組中獨(dú)特有效序列的比值較P組高,提示牙周健康組織中具有更為豐富的T細(xì)胞克隆。4.各牙齦組織樣本中TCRβ鏈CDR3的多樣性分析:各樣本的反辛普森指數(shù)(1/DS)為:H1:313.12,H2:91.06,H3:167.77,H4:140.44,H5:514.62,P1:304.54,P2:492.33,P3:199.39,P4:79.37,P5:73.97。統(tǒng)計(jì)分析顯示,H組中1/DS高于P組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。各樣本前5條高頻克隆增殖序列中未出現(xiàn)完全相同的序列,但發(fā)現(xiàn)“YEQY”這個(gè)氨基酸基序在兩組中均高頻出現(xiàn);而“ETQY”這個(gè)氨基酸基序只在P組中發(fā)現(xiàn)。P組中獨(dú)特高度保守的氨基酸基序提示可能與重度慢性牙周炎患者牙周局部環(huán)境對(duì)特異性抗原所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答有關(guān)。5.各牙齦組織樣本中TCRβ鏈CDR3組庫(kù)TRBV、TRBJ基因家族及V-J配對(duì)取用:(1)H組及P組牙齦組織中均高頻(2%)取用的TRBV基因有:TRBV10-3、TRBV19、TRBV2、TRBV20-1、TRBV29-1、TRBV5-1、TRBV7-2、TRBV7-9、TRBV9。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P組牙齦組織總T細(xì)胞的TCRβ鏈CDR3組庫(kù)對(duì)TRBV6-8基因的取用頻率較H組顯著升高(P0.05)。(2)H組及P組均高頻(5%)取用的TRBJ基因包括:TRBJ1-2、TRBJ1-5、TRBJ2-1、TRBJ2-7。統(tǒng)計(jì)分析顯示,與H組比較,P組牙齦組織總T細(xì)胞的TCRβ鏈CDR3組庫(kù)對(duì)TRBJ2-5基因的取用頻率顯著升高(P0.05)。(3)H、P兩組共同的優(yōu)勢(shì)配對(duì)(1%)基因包括:TRBV19-TRBJ2-7、TRBV2-TRBJ2-7、TRBV20-1-TRBJ1-2、TRBV20-1-TRBJ2-1、TRBV20-1-TRBJ2-7、TRBV5-1-TRBJ2-7、TRBV7-9-TRBJ2-7。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,與H組相比,P組牙齦組織總T細(xì)胞的TCRβ鏈CDR3組庫(kù)對(duì)TRBV10-3-TRBJ2-5、TRBV11-2-TRBJ2-3、TRBV12-5-TRBJ1-5、TRBV29-1-TRBJ2-5、TRBV30-TRBJ2-1、TRBV5-1-TRBJ2-5、TRBV5-6-TRBJ2-7、TRBV5-8-TRBJ2-1、TRBV6-8-TRBJ1-2、TRBV7-9-TRBJ2-5、TRBV9-TRBJ2-1基因配對(duì)取用頻率顯著升高(P0.05)。其基因的差異性取用可能與牙周局部環(huán)境對(duì)不同抗原所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答有關(guān)。6.各牙齦組織樣本中TCRβ鏈CDR3氨基酸長(zhǎng)度和取用分析:H組及P組牙齦組織TCRβ鏈CDR3氨基酸長(zhǎng)度分布,均以12個(gè)氨基酸長(zhǎng)度為主的正態(tài)分布;經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩組氨基酸長(zhǎng)度分布的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。H組、P組牙齦組織TCRβ鏈CDR3區(qū)均高頻取用絲氨酸(S),兩組氨基酸取用無(wú)顯著差異(P0.05)。氨基酸位點(diǎn)取用分析發(fā)現(xiàn)H、P組105位點(diǎn)高頻取用丙氨酸(A),106、107位點(diǎn)均高頻取用絲氨酸(S),115位點(diǎn)高頻取用谷氨酸(E),116位點(diǎn)高頻取用谷氨酰胺(Q),117位點(diǎn)高頻取用絡(luò)氨酸(Y);而108、109、110、112、113、114位點(diǎn)的氨基酸取用呈現(xiàn)多樣性,從而影響TCRβ鏈CDR3組庫(kù)的克隆增殖情況。7.各牙齦組織樣本中TCRβ鏈CDR3組庫(kù)中獨(dú)特氨基酸重疊序列:H組5例患者TCRβ鏈CDR3組庫(kù)中共同取用的獨(dú)特氨基酸序列數(shù)目為129條,P組5例患者TCRβ鏈CDR3組庫(kù)中共同取用的獨(dú)特氨基酸序列數(shù)目為11條;H組及P組10個(gè)樣本之間共同取用的獨(dú)特氨基酸序列數(shù)目為6條。8.H、P兩組TCRβ鏈CDR3組庫(kù)中核苷酸的剪切與插入:對(duì)兩組TCRβ鏈CDR3區(qū)中核苷酸的剪切/插入經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn),與H組相比,P組患者牙齦組織中TCRβ鏈CDR3區(qū)中V deletions、N1 insertions、D5 deletions數(shù)目顯著降低(P0.05)。提示H組TCRβ鏈CDR3受體庫(kù)的組成更加豐富,進(jìn)而可對(duì)更多的抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答。結(jié)論:1.H組、P組患者有著不同的齦下菌群構(gòu)成,P組患者齦下菌群的多樣性較H組患者低。兩組中具有各自獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)菌群,且物種的組成具有顯著的差異。2.H組TCRβ鏈CDR3組庫(kù)的多樣性比P組高,但氨基酸長(zhǎng)度及氨基酸的取用差異不顯著。部分TRBV、TRBJ基因家族的取用、TRBV-TRBJ配對(duì)取用出現(xiàn)顯著的差異,且CDR3區(qū)核苷酸的剪切/插入數(shù)目也存在明顯差異。提示H組、P組齦下微生物組成可能影響牙齦組織中TCRβ鏈CDR3組庫(kù)的構(gòu)成,其差異表達(dá)的基因可能與牙周微環(huán)境中不同抗原所產(chǎn)生的特異性免疫應(yīng)答有關(guān)。
【圖文】：

（6）電泳完畢后取出凝膠，置于凝膠成像儀中觀察 DNA 條帶，并保存凝膠圖像。1.2.6 TCR β鏈 CDR3 組庫(kù)制備技術(shù)根據(jù)樣品檢測(cè)結(jié)果計(jì)算出需取用的DNA樣品量，DNA 起始量400ng。將上述樣本加入特意設(shè)計(jì)的 V 區(qū)引物和J 區(qū)引物使用QIAGEN Multiplex PCR Kit進(jìn)行多重PCR 反應(yīng)。將多重 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳，使用QIAquick Gel Extraction Kit 進(jìn)行膠回收。將純化回收的 DNA 使用Quibt 熒光儀進(jìn)行濃度檢測(cè)，總量大于50ng 即可進(jìn)行下游常規(guī)建庫(kù)。按照末端修復(fù)體系配置相應(yīng)反應(yīng)液，進(jìn)行末端修復(fù)反應(yīng)后使用QIAquick PCR Purification Kit 進(jìn)行純化。將上一步末端修復(fù)的DNA進(jìn)行3’端加“A”、加接頭反應(yīng)并使用QIAquick PCR Purification Kit 進(jìn)行純化。將上一步純化好的 DNA 產(chǎn)物使用包含Illumina 測(cè)序FlowCell 及index 序列的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收片段后，使用QIAquick Gel Extraction Kit 進(jìn)行膠純化回收，溶于Elution Buffer 中，文庫(kù)構(gòu)建完成。建庫(kù)原理如圖1。

按納入標(biāo)準(zhǔn)選取牙周健康病例 5 例，命名為：H1、H2、H3、H4、H5；重度慢牙周炎病例 5 例，命名為；P1、P2、P3、P4、P5；兩組代表性影像資料（圖 2A、分別采集各樣本的齦下菌斑及牙齦組織（圖 2C、D），進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。對(duì)比兩PD、AL、BOP 的改變（表 1），結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A BC D
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R781.42

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本文編號(hào)：2669741