【摘要】：目的:雪旺氏細胞(Schwann cells, SCs)是包裹外周神經(jīng)的膠質(zhì)細胞,亦稱神經(jīng)膜細胞或鞘細胞。雪旺氏細胞包繞外周神經(jīng)纖維束,構(gòu)成有髓神經(jīng)纖維,成為有髓神經(jīng)的組成成份。 涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)是最常見的涎腺惡性腫瘤,易于早期浸潤神經(jīng)。在臨床上引起感覺異常、麻木和疼痛。以往認為腫瘤對神經(jīng)的侵犯僅僅是一種占位,或“和平共處”,腫瘤不直接破壞神經(jīng)本身。然而,腫瘤的嗜神經(jīng)生長能否對神經(jīng)造成直接破壞或侵蝕?目前尚不清楚。 SACC中的腫瘤性肌上皮細胞(neoplastic myoepithelial cells, NMCs)具有雙向分化潛能,能夠分泌產(chǎn)生蛋白多糖(proteoglycans, PGs)。PGs是由一種由核心蛋白連接氨基葡聚糖(glycosaminoglycans, GAGs)所構(gòu)成的大分子糖蛋白,提供腫瘤的細胞外間質(zhì),對于腫瘤的增殖、侵襲、分化和轉(zhuǎn)移都具有重要作用。但是PG在SACC對神經(jīng)的侵犯和破壞中是否具有作用?目前的研究報道較少。在細胞中,PG的生物合成是在木糖基轉(zhuǎn)移酶( Xylosyltransferase , XT )催化下起始的。木糖基轉(zhuǎn)移酶-I(Xylosyltransferase,XT-Ⅰ)催化的是PG合成中的效率-限制性階段(rate-limited step),對于PG的生物合成至關(guān)重要。 目前應(yīng)用廣泛的RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù),是在細胞中導入與靶基因的mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA(dsRNA),使mRNA發(fā)生降解,導致基因表達沉默。 本研究體外培養(yǎng)人外周有髓神經(jīng)雪旺氏細胞(Human Schwann cells, HSc),與SACC細胞共培養(yǎng),觀察SACC細胞對人神經(jīng)雪旺氏細胞的侵襲及破壞情況。并應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制SACC細胞的PG分泌,觀察PG阻抑前后SACC細胞對人神經(jīng)雪旺氏細胞的侵襲和破壞作用。以探討和證實(1)SACC細胞對人外周有髓神經(jīng)雪旺氏細胞有無直接破壞?(2)PG在SACC細胞對人外周有髓神經(jīng)雪旺氏細胞破壞中有無發(fā)揮作用? 方法: 1細胞培養(yǎng):采用RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)SACC-83細胞;用DMED:F12培養(yǎng)液原代培養(yǎng)人神經(jīng)雪旺氏細胞(human Schwann cells)。并通過免疫細胞化學方法,應(yīng)用細胞角蛋白和肌球蛋白單克隆抗體鑒定SACC-83,S-100蛋白單克隆抗體鑒定人神經(jīng)雪旺氏細胞; 2細胞轉(zhuǎn)染:將shRNA真核表達載體shRNA-WJ4(阻抑組)和shRNA-HK(陰性對照)通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SACC-83細胞,沉默其XT-Ⅰ基因的表達;未轉(zhuǎn)染shRNA真核載體的SACC-83細胞(未轉(zhuǎn)染組)作為對照。 3 XT-Ⅰ基因檢測:采用Real-Time PCR技術(shù),從mRNA水平檢測RNAi后SACC-83細胞XT-Ⅰ基因的表達; 4 PG含量測定:應(yīng)用Blyscan Assay Kit試劑盒檢測基因沉默48h內(nèi)SACC-83細胞PG合成分泌的改變; 5腫瘤侵襲性觀察:將阻抑組SACC-83-WJ4細胞、對照組SACC-83-HK和未轉(zhuǎn)染組SACC-83分別與在24孔板培養(yǎng)的人神經(jīng)雪旺氏細胞混合培養(yǎng)24 h,在倒置熒光顯微鏡和掃描電鏡(Scanning electron microscope, SEM)下進行觀察,且對其進行固定后應(yīng)用免疫組織化學染色,區(qū)分腫瘤細胞和人神經(jīng)雪旺氏細胞以便于人神經(jīng)雪旺氏細胞進行侵襲率的計數(shù)。 6統(tǒng)計學分析:所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行方差分析,P0.01表示具有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果: 1原代培養(yǎng)人神經(jīng)雪旺氏細胞,進行S-100蛋白免疫細胞化學鑒定。人神經(jīng)雪旺氏細胞胞漿呈棕褐色。SACC-83細胞對抗角蛋白CK和肌球蛋白myosin免疫細胞化學染色,細胞呈陽性表達。 2 shRNA-WJ4(阻抑組)、shRNA-HK(陰性對照)成功轉(zhuǎn)染SACC-83細胞,轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)轉(zhuǎn)染效率分別為51.44%、58.70%。SACC-83(未轉(zhuǎn)染組)不顯示熒光。 3基因轉(zhuǎn)染48 h后,Real-Time PCR時實定量檢測發(fā)現(xiàn),shRNA-WJ4中XT-Ⅰ基因mRNA沉默效率為49%。 4基因轉(zhuǎn)染后48 h培養(yǎng)液Blyscan Assay Kit檢測發(fā)現(xiàn),PG分泌降低。SACC-83-WJ4組PG合成抑制率為41.32%。 5光鏡和掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),在SACC-83組中腫瘤細胞有聚集趨向,共同攻擊人神經(jīng)雪旺氏細胞;人神經(jīng)雪旺氏細胞受到腫瘤細胞的直接侵襲和破壞后,細胞漿離散解體,胞核固縮。而阻抑PG分泌的SACC-83- WJ4組中的腫瘤細胞,遠離人神經(jīng)雪旺氏細胞,對雪旺氏細胞不產(chǎn)生侵蝕和破壞作用。 結(jié)論: 1人SACC細胞能直接浸潤和破壞人外周神經(jīng)。 2蛋白多糖在SACC細胞對人外周神經(jīng)的破壞中發(fā)揮重要作用。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R739.8

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