發(fā)布時間：2020-05-14 21:22

【摘要】：背景和目的 干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞,它包括胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞由于倫理學(xué)問題在臨床上的應(yīng)用受到限制.成體干細(xì)胞通常以極少量的數(shù)量存在于局限的區(qū)域。從不同組織中分離成體干細(xì)胞目前尚無統(tǒng)一、理想的方法,主要是根據(jù)干細(xì)胞具有克隆形成能力的普遍特點(diǎn)和不同干細(xì)胞所特有的生物、物理學(xué)特性進(jìn)行分離和鑒定的。采用Stro-1抗體免疫磁珠分離或Stro-1抗體通過流式細(xì)胞分選是目前較為公認(rèn)的有效分離方法。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells, BMSCs)是骨髓基質(zhì)中的干細(xì)胞,是目前研究最充分、應(yīng)用最廣泛的干細(xì)胞。已有研究表明,牙周膜中存在著干細(xì)胞,表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記物Stro-1,并具有多向分化潛能,稱為牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligment stem cells, PDLSCs),可作為牙周再生的種子細(xì)胞。 干細(xì)胞在臨床治療中的應(yīng)用越來越廣泛,研究表明,其增殖與分化是影響治療效果的關(guān)鍵因素。干細(xì)胞的增殖和分化受多種內(nèi)在機(jī)制和微環(huán)境因素的影響。微環(huán)境是影響干細(xì)胞移植治療效果、影響組織再生的重要因素。在組織再生的過程中經(jīng)常會遇到因遭到嚴(yán)重破壞而發(fā)生炎性反應(yīng)的過程。干細(xì)胞處于炎性微環(huán)境中,其增殖和分化的調(diào)控很可能受到炎性因子的影響。炎性微環(huán)境中的炎性分子包括內(nèi)源性的炎性介質(zhì)(TNF-α, IL-1β, PGE2等)以及外源性分子(細(xì)菌脂多糖lipopolysaccharide, LPS,磨損顆粒particulate debris,機(jī)械張力或剪切力等)。其中TNF-α是目前公認(rèn)的最重要的一個內(nèi)源性誘生型促炎細(xì)胞因子,也是內(nèi)毒素引起的感染性疾病最直接最關(guān)鍵的炎癥介質(zhì)。TNF-α通過激活靶細(xì)胞內(nèi)MAPKS與NF-κB通路使細(xì)胞發(fā)生增殖、分化、炎癥等應(yīng)激反應(yīng)。NF-κB是一種廣泛存在于體內(nèi)細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子、粘附分子、免疫受體基因的表達(dá),影響機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞分化、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、腫瘤生長等多種生物學(xué)功能。 現(xiàn)有研究結(jié)果顯示炎性因子能夠影響成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)、細(xì)胞外基質(zhì)的分泌以及成骨細(xì)胞的凋亡。然而,這些研究大都以鼠成骨細(xì)胞系為研究對象,并沒有說明干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程中炎性信號通路的作用。因此,在組織再生過程中,慢性、長期、高濃度的炎性微環(huán)境對于成體干細(xì)胞增殖和分化的影響亟需深入的研究。本研究采用免疫磁珠法分離PDLSCs和BMSCs,以不同濃度TNF-α刺激PDLSCs和BMSCs,探討TNF-α對PDLSCs和BMSCs增殖和成骨分化的影響；并對這種影響的信號通路進(jìn)行了初步探討；同時進(jìn)行體內(nèi)實驗,觀察在BMSCs中阻斷NF-κB通路對于骨創(chuàng)傷愈合的影響,以期更好地了解炎癥刺激條件下成體干細(xì)胞的生物學(xué)特性以及基于成體干細(xì)胞的創(chuàng)傷修復(fù)過程,為臨床研發(fā)新的更有效的牙周治療方法開辟一條新思路。 材料和方法 1. TNF-α對PDLSCs和BMSCs增殖和成骨分化影響的研究 組織塊法分離培養(yǎng)人原代牙周膜細(xì)胞,復(fù)蘇-80℃凍存的ST2細(xì)胞,傳代培養(yǎng),細(xì)胞生長狀態(tài)良好后用生物素標(biāo)記的Stro-1抗體,免疫磁珠正選法分離PDLSCs和ST2細(xì)胞中BMSCs,免疫細(xì)胞化學(xué)染色和礦化誘導(dǎo)初步鑒定其干細(xì)胞特性；MTT法檢測不同濃度TNF-α對PDLSCs和BMSCs增殖的影響；PNPP法檢測礦化誘導(dǎo)條件下不同濃度TNF-α對PDLSCs和BMSCs堿性磷酸酶活力的影響；實時定量PCR檢測不同濃度TNF-α對PDLSCs和BMSCs成骨分化基因OSX, RUNX2, ALP, OC mRNA的影響；礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色法檢測不同濃度TNF-α對PDLSCs和BMSCs礦化的影響。 2. TNF-α對BMSCs增殖和成骨分化影響的信號通路研究 用脂質(zhì)體法將IκBα-mut轉(zhuǎn)入逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞PT67,嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定的產(chǎn)毒細(xì)胞株；然后用含IκBα-mut病毒的培養(yǎng)液感染BMSCs,嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定超表達(dá)IκBα-mut的BMSCs; MTT法檢測不同濃度TNF-α對穩(wěn)定超表達(dá)IκBα-mut的BMSCs增殖的影響；PNPP法檢測礦化誘導(dǎo)條件下不同濃度TNF-α對穩(wěn)定超表達(dá)IκBα-mut的BMSCs堿性磷酸酶活力的影響；實時定量PCR檢測不同濃度TNF-α對穩(wěn)定超表達(dá)IκBα-mut的BMSCs成骨分化基因OSX, RUNX2,ALP, OC mRNA的影響；礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色法檢測不同濃度TNF-α對穩(wěn)定超表達(dá)ⅠκBa-mut的BMSCs礦化的影響。 3. TNF-α對小鼠骨創(chuàng)傷修復(fù)影響的研究 采用全血貼壁法分離、培養(yǎng)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells BMSCs),并用前述方法將細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pBabe-puro-IκBα-mut,獲得穩(wěn)定超表達(dá)IκBa-mut的BMSCs;制備小鼠顱骨缺損模型,進(jìn)行動物實驗,分組如下： BALB/c小鼠15只,體重18-20g,共分為3組,每組5只。 A組顱骨缺損,缺損區(qū)植入BMSCs,腹腔注射PBS B組顱骨缺損,缺損區(qū)植入BMSCs,隔日腹腔注射TNF-α5ug/kg C組顱骨缺損,缺損區(qū)植入穩(wěn)定超表達(dá)IκBa-mut的BMSCs,隔日腹腔注射TNF-a5ug/kg 兩周后取顱骨標(biāo)本,進(jìn)行大體觀察,HE染色,計算各組新骨生成面積并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果 1.TNF-α對PDLSCs和BMSCs曾殖和成骨分化的影響 (1)分離得到的牙周膜干細(xì)胞約為0.1%,經(jīng)SP免疫細(xì)胞化學(xué)檢測,牙周膜干細(xì)胞抗波形絲蛋白(Vimentin)染色陽性,抗角蛋白染色陰性,抗Stro-1染色陽性,具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。礦化液連續(xù)培養(yǎng)21d, Vonkossa染色可見染成棕褐色的礦化結(jié)節(jié)。分離得到的Stro-1+BMSCs細(xì)胞比例約為30%,14d行茜素紅染色可見染成鮮紅色的礦化結(jié)節(jié)。 (2)MTT結(jié)果顯示：與對照組相比,不同濃度的TNFa(0.01-100ng/ml)對PDLSCs和BMSCs增殖的影響沒有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。 (3)與對照組(Ong/mlTNF-a)相比,加入含TNF-α的礦化誘導(dǎo)液48hr后,PDLSCs和BMSCs堿性磷酸酶活力(ALP activity)在低濃度時(0.01,0.1ng/ml)增加,在高濃度(10,100ng/ml)時下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。 (4)與對照組(Ong/mlTNF-a)相比,加入含TNF-α的礦化誘導(dǎo)液48hr后,PDLSCs和BMSCs成骨分化基因(RUNX2、OSX、ALP和OC) mRNA在低濃度時(0.01,0.1ng/ml)增加,在高濃度(10,100ng/ml)時下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。 (5)與對照組(Ong/mlTNF-α)相比,加入含TNF-α(0.1,1,100ng/ml)的礦化誘導(dǎo)液4周后,PDLSCs和BMSCs所形成的礦化結(jié)節(jié)量明顯減少(p0.05)。 2.TNF一α對BMSCs增殖和成骨分化影響的信號通路 (1) BMSCs穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pBabe-puro—IκBα-mut后,NF-κB通路被成功阻斷,Weston blot顯示：胞漿內(nèi)IκBα蛋白質(zhì)的含量增加,胞核內(nèi)p65蛋白質(zhì)含量比轉(zhuǎn)染空載體組減少。 (2)NF-κB通路被阻斷后,TNF-α呈濃度依賴性抑制BMSCs的增殖。 (3)NF-κB通路被阻斷后,可以逆轉(zhuǎn)高濃度TNF-α(10,100ng/ml)對BMSCs堿性磷酸酶活力的影響,而對低濃度TNF-α(0.01,0.1ng/ml)對BMSCs堿性磷酸酶活力的影響沒有作用。 (4)NF-κB通路被阻斷后,可以逆轉(zhuǎn)高濃度TNF-α(10,100ng/ml)對BMSCs成骨分化基因的影響,而對低濃度TNF-α(0.01,0.1ng/ml)對BMSCs成骨分化基因的影響沒有作用。 (5)NF-κB通路被阻斷后,可以逆轉(zhuǎn)長時間(4周)高濃度TNF-α(10ng/ml)對BMSCs礦化的影響。 3.TNF-α對小鼠骨創(chuàng)傷修復(fù)影響的研究 體內(nèi)實驗結(jié)果顯示：正常情況下,植入同種異體BMSCs,可以促進(jìn)顱骨缺損的修復(fù)；但在TNF-α刺激下,再植入同種異體BMSCs,小鼠顱骨缺損的修復(fù)能力比正常情況下明顯降低,新骨生成面積明顯減少。相反地,植入了NF-κB通路被阻斷的同種異體BMSCs后,骨的再生能力明顯增強(qiáng),可以達(dá)到和正常情況下的新骨生成面積。結(jié)果表明：NF-κB通路被阻斷后,可以逆轉(zhuǎn)長期高濃度TNF-α對骨缺損修復(fù)的抑制作用。 結(jié)論 (1)采用免疫磁珠法成功分離培養(yǎng)了PDLSCs和BMSCs,并進(jìn)行了初步鑒定,干細(xì)胞免疫磁珠分離法簡便易行,值得推廣。 (2)不同濃度不同時間TNF-α對干細(xì)胞成骨分化的影響不同,長時間高濃度抑制干細(xì)胞的成骨分化,短時間低濃度的TNF-α對干細(xì)胞成骨分化有增強(qiáng)作用。 (3)NF-κB通路被阻斷后,可以逆轉(zhuǎn)高濃度TNF-α對干細(xì)胞成骨分化的作用,提示長時間高濃度TNF-α抑制干細(xì)胞的成骨分化是通過NF-κB信號通路。 (4)高濃度TNF-α長期刺激影響干細(xì)胞在骨缺損中的修復(fù)功能,阻斷NF-κB通路逆轉(zhuǎn)長期高濃度TNF-α對骨缺損修復(fù)的抑制作用,提高修復(fù)效果。 (5)不同濃度TNF-α對干細(xì)胞的增殖影響不同,是多條信號通路相互作用的結(jié)果。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R780.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 魏東;章曉蕾;;牙周病患者血清IL-1β和TNF-α檢測的臨床意義[J];放射免疫學(xué)雜志;2006年06期

2 高秦;劉宏偉;金巖;聶鑫;劉源;;人牙周膜干細(xì)胞的體外分離、純化及初步鑒定[J];實用口腔醫(yī)學(xué)雜志;2006年01期

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本文編號：2663954