【摘要】：一、它莫西芬誘導型可逆永生化小鼠牙乳頭細胞系的建立和鑒定 研究目的：成牙本質(zhì)細胞是一種可分泌礦化基質(zhì)的終末分化細胞,在牙髓牙本質(zhì)復合體中發(fā)揮重要作用。小鼠牙乳頭細胞(mDPCs)在體外誘導條件下可分化成成牙本質(zhì)細胞樣細胞。但是由于繁瑣的原代培養(yǎng)過程和細胞有限的壽命,在實驗過程中不易獲得穩(wěn)定的細胞來源。為解決該問題,本研究將傳統(tǒng)的基于Cre/LoxP的可逆永生化系統(tǒng)與它莫西芬誘導的Cre重組酶系統(tǒng)相結合,試圖建立一個它莫西芬誘導型可逆永生化小鼠牙乳頭細胞系,并對其進行鑒定。 研究方法：首先使用慢病毒介導的方法將已插入LoxP位點的SV40Tag-TK表達載體轉(zhuǎn)染入原代培養(yǎng)的mDPCs。經(jīng)過GCV篩選和單克隆篩選獲得一個穩(wěn)定表達SV40Tag并持續(xù)增值的克隆-mDPC6T,進而在mDPC6T過表達含有雌激素受體的ERT2CreERT2重組酶。經(jīng)單克隆篩選SV40Tag和Cre陽性細胞,獲得細胞系mDPCET。 mDPCET經(jīng)過4-羥基它莫西芬(4-OHT)處理后獲得逆永生化細胞。通過EdU摻入實驗和PDLs計數(shù)法檢測原代mDPCs、mDPCET和逆永生化細胞的細胞增殖動力學,通過免疫熒光、Real-time RT-PCR和Western Blot檢測成牙本質(zhì)相關標志物,茜素紅染色檢測細胞在誘導條件下礦化結節(jié)的形成。 研究結果：與原代細胞相比,mDPCET增殖能力顯著上調(diào),壽命延長,但是同時保持了原代mDPCs的大部分生化和功能特性,當mDPCET細胞在4-OHT處理條件下,ERT2Cre ERT2從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核,從而敲除已轉(zhuǎn)入的SV40Tag-TK,使mDPCET發(fā)生逆永生化。與mDPCET相比,逆永生細胞的成牙本質(zhì)相關基因及礦化結節(jié)形成能力顯著上調(diào),并重新獲得可發(fā)生復制性衰老的能力。 結論：建立并鑒定了一個它莫西芬誘導型可逆永生化小鼠牙乳頭細胞系mDPCET。經(jīng)4-OHT處理后,mDPCET可發(fā)生逆永生化,逆永生化細胞呈現(xiàn)低增殖高分化的狀態(tài),并重獲可衰老的能力,這種狀態(tài)更加類似分化的成牙本質(zhì)細胞。 二、Klf4通過調(diào)控Dmp1促進小鼠牙乳頭細胞向成牙本質(zhì)細胞樣細胞分化 研究目的：成牙本質(zhì)細胞來源于牙乳頭,是一種具有分泌基質(zhì)功能的終未分化細胞。在成牙本質(zhì)細胞分化過程中多種轉(zhuǎn)錄因子參與了調(diào)控。本課題組過去的研究發(fā)現(xiàn),Kruppel-like factor4(Klf4)特異性表達在極化和延伸期的成牙本質(zhì)細胞中,但是Klf4在成牙本質(zhì)細胞分化過程中的作用尚不明確。本研究試圖探索Klf4在成牙本質(zhì)細胞分化過程中的功能,并分析其調(diào)控成牙本質(zhì)細胞分化的分子機制。 研究方法：在本研究中,使用礦化誘導液在體外誘導小鼠原代牙乳頭細胞(mDPCs)和小鼠牙乳頭細胞系即mDPC6T向成牙本質(zhì)細胞樣細胞分化作為研究模型。檢測誘導過程中Klf4的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平、堿性磷酸酶活性和成牙本質(zhì)細胞分化相關基因(Dspp、Dmp1和Alp)的表達：同時通過EdU摻入法檢測細胞的增殖能力。在Klf4過表達和抑制條件下檢測成牙本質(zhì)細胞分化相關基因(Dspp、Dmp1和Alp)的表達和堿性磷酸酶活性,同時通過EdU摻入法檢測細胞的增殖能力,茜素紅染色檢測礦化結節(jié)的形成。生物信息學預測Klf4潛在的下游基因Dmp1,并通過染色體免疫共沉淀(ChIP)、凝膠電泳遷移實驗(EMSA)、雙熒光素酶報告實驗(DLA)檢測Klf4對Dmp1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在Klf4抑制條件下過表達Dmp1,檢測Dmp1與Klf4間的調(diào)控關系。 研究結果：Klf4在mDPCs和mDPC6T向成牙本質(zhì)細胞樣細胞分化過程中表達顯著上調(diào)。過表達Klf4顯著上調(diào)成牙本質(zhì)相關基因,如Dmp1、Dspp和Alp,并可促進礦化結節(jié)的形成。抑制Klf4表達可下調(diào)Dmp1、Dspp和Alp的表達,并抑制礦化結節(jié)形成。生物信息學預測Klf4潛在的下游基因Dmp1。通過ChIP、EMSA和DLA的進一步分析,表明Klf4特異性結合于Dmp1啟動子區(qū),并轉(zhuǎn)錄激活其表達。Dmp1過表達可部分挽救由抑制Klf4表達對成牙本質(zhì)分化的阻礙作用。 結論：Klf4通過結合于Dmp1啟動子上特定區(qū)域,轉(zhuǎn)錄上調(diào)Dmp1表達,從而促進成牙本質(zhì)細胞分化。 三、間充質(zhì)中條件性敲除Klf4影響牙本質(zhì)的礦化 研究目的：Klf4(Kruppel-like factor4)又稱為GKlf或Ezf,是Klf4鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,在器官發(fā)育、干細胞干性維持和腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。過去的研究發(fā)現(xiàn)Klf4特異性表達在極化和延伸期的成牙本質(zhì)細胞中。在實驗二中,通過體外研究探索了Klf4在成牙本質(zhì)細胞分化中的作用。但是,體內(nèi)環(huán)境下Klf4對成牙本質(zhì)細胞分化和牙本質(zhì)形成的調(diào)控作用還未可知。本研究試圖探索在牙胚間充質(zhì)中條件性敲除Klf4對成牙本質(zhì)細胞分化和牙本質(zhì)形成的影響。 研究方法：將Wnt1-Cre:Klf4f/+小鼠與Klf4f/f小鼠交配就可以得到Wnt1-Cre；Klf4f/f,即在神經(jīng)嵴來源的細胞中特異的失活Klf4的小鼠。Wnt1-Cre與R26R-LacZ(?)小鼠交配獲得Wnt1-cre;R26R-LacZ即神經(jīng)嵴來源的細胞呈x-gal染色陽性的小鼠。胎齡計算時以查到孕栓的當天中午計為胚胎E0.5天,小鼠出生當天中午計為出生后PN0.5天。按胎齡或出生后日齡獲得的小鼠,分離尾鼠織,提取基因組DNA進行基因型鑒定。同一窩小鼠中基因型為Klf4f/+小鼠設為對照組小鼠,將基因型為Wnt1-cre；Klf4f/f小鼠設為實驗組小鼠,即條件性敲除小鼠。分離小鼠下頜骨,體式顯微鏡照相,X-ray檢測礦化組織密度,另外一部分組織經(jīng)過固定,脫水,透明,石蠟包埋,切片用來進行組織學染色分析和免疫組化分析實驗。 研究結果：Wnt1-cre;R26R-LacZ經(jīng)X-gal染色確認Cre重組酶在牙胚間充質(zhì)細胞中被激活。免疫組織化學檢測結果顯示,在對照組(Klf4f/+)中,KLF4表達在E18.5與PN0.5的牙尖頂端分化的成牙本質(zhì)細胞和成釉細胞中,在實驗組中(Wnt1-cre;Klf4f/f) KLF4僅表達在PN0.5的牙尖頂端分化的成釉細胞中,成牙本質(zhì)細胞不表達KLF4。HE染色結果顯示在PN1W和PN2W的Klf4條件性敲除小鼠標本中,前期牙本質(zhì)顯著增厚。而Azan染色結果也發(fā)現(xiàn)Klf4條件性敲除小鼠的牙本質(zhì)出現(xiàn)淡染。高分辨X-ray顯示Klf4條件性敲除小鼠牙本質(zhì)灰度顯著下降,而牙釉質(zhì)未發(fā)現(xiàn)顯著的灰度改變。更有意思的是在PN3M時,2/4的Klf4條件性敲除小鼠出現(xiàn)齲損,并累及所有下頜磨牙,而對照小鼠未見齲損發(fā)生。 結論：牙胚間充質(zhì)中條件性敲除Klf4影響牙本質(zhì)的礦化。
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R780.2

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 陳小紅,高瑞蘭,徐衛(wèi)紅,金錦梅,林筱潔;人參皂甙對紅系、粒單系、巨核系細胞株的增殖及轉(zhuǎn)錄因子的誘導作用[J];中國中西醫(yī)結合雜志;2001年01期

，

本文編號：2662223