【摘要】：目的：齲病是口腔的常見病多發(fā)病,并已經(jīng)成為嚴重危害人類健康及生活質(zhì)量的疾病。目前,我國的齲病處于高發(fā)狀態(tài),迫切需要尋求有效的防齲方法來提高口腔健康防治水平。變形鏈球菌是人類齲病的主要致病菌,通過對變形鏈球菌進行結(jié)構(gòu)基因組學(xué)方面的研究,更好地理解該菌基因的復(fù)雜性和特異性,其如何攝取營養(yǎng)、抵抗宿主防御以適應(yīng)口腔環(huán)境,為新的防治齲病措施的發(fā)現(xiàn)和新藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。 方法：蛋白質(zhì)晶體學(xué)是結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的主要研究手段,可用于解析蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)及基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計方面的研究。本實驗利用北京大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)實驗室高通量結(jié)構(gòu)基因組學(xué)實驗平臺,通過靶基因篩選、高通量自動化基因克隆和表達、高通量蛋白純化、晶體篩選、晶體衍射數(shù)據(jù)收集和晶體結(jié)構(gòu)解析的一整套實驗流程進行致齲性變形鏈球菌蛋白的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究。 結(jié)果：本論文的主要工作是對變形鏈球菌基因組中的兩個基因：SMU.2055、SMU.1254進行了蛋白純化和晶體篩選工作。目的基因被克隆并連入pET28a載體中,SMU.2055、SMU.1254在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中表達、可溶性良好并獲得了可溶性較高的蛋白。用金屬鎳螯合層析和凝膠排阻層析對蛋白進行純化得到較為均一的目的蛋白,再以坐滴蒸汽擴散法初篩得到目的蛋白的晶體,并通過進一步的優(yōu)化得到適合上機衍射和數(shù)據(jù)收集的晶體。其中,SMU.2055的蛋白晶體和其硒代甲硫氨酸蛋白晶體的衍射數(shù)據(jù)已經(jīng)被收集,蛋白結(jié)構(gòu)已解析(PDB：3LD2)。SMU.1254的蛋白晶體及其泡重原子晶體衍生物的衍射數(shù)據(jù)已經(jīng)被收集,蛋白結(jié)構(gòu)還在解析之中。 結(jié)論：致齲性變形鏈球菌SMU.2055、SMU.1254蛋白的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)及蛋白質(zhì)晶體學(xué)的研究,原子水平上深入了解變形鏈球菌中蛋白的結(jié)構(gòu)和功能,為更好的研究變形鏈球菌蛋白在生物體內(nèi)代謝及齲病發(fā)生、發(fā)展進程中的生物學(xué)功能作用奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

sMu.707(自溶素)、sMU.574(LrgB家族蛋白)，具有與細胞分裂及細胞壁合成相關(guān)的功能。變形鏈球菌通過糖酵解、脂肪酸生物合成、非氧化性磷酸戊糖途徑代謝過程由宿主攝取營養(yǎng)物質(zhì)(見圖1)，其中 SMU.1534一1541還參與淀粉酶和支鏈淀粉酶的降解過程。變形鏈球菌中的粘附素、胞外酶、蛋白酶、細胞因子等毒力因子參與抵抗宿主防御以及與其他細菌競爭〔10]。s.二taI7s全基因組序列的測定使得人們能更好地理解該菌基因的復(fù)雜性和特異性，其如何攝取營養(yǎng)、抵抗宿主防御以適應(yīng)口腔環(huán)境，，這些發(fā)現(xiàn)為新的防治齲病措施的發(fā)現(xiàn)及新藥物的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

圖4Superdex75洗脫峰位置與蛋白分子量對應(yīng)圖目前對于pET系統(tǒng)表達的帶有HIS標簽的融合蛋白已有一套比較成熟的蛋白純化流程。實驗采用GE公司生產(chǎn)的快速蛋白液相色譜純化系統(tǒng)，依次經(jīng)過金屬鰲合層析和凝膠排阻層析兩步后可以基本得到培養(yǎng)蛋白質(zhì)晶體所需的電泳純蛋白。九、蛋白質(zhì)結(jié)晶及結(jié)晶條件的篩選和優(yōu)化l、蛋白結(jié)晶是一個液相與固相轉(zhuǎn)換的過程，即液相中隨機分布的分子轉(zhuǎn)變成有規(guī)則排列的固相。當?shù)鞍踪|(zhì)溶液達到過飽和時，溶液中就會形成晶核，隨后蛋白分子不斷結(jié)合到晶核上形成晶體。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R780.2

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