【摘要】：研究目的 1.分析應(yīng)用自噬抑制劑對順鉑(cis-Dichlorodiamineplatinum,DDP)誘導(dǎo)涎腺腺樣囊性癌細胞死亡和細胞凋亡的影響。 2.分析應(yīng)用轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默自噬基因抑制自噬對涎腺腺樣囊性癌細胞死亡和細胞凋亡的影響。 3.分析Bcl-2在DDP誘導(dǎo)涎腺腺樣囊性癌細胞自噬和細胞凋亡中的變化。 4.分析P53-AMPK-mTOR相關(guān)蛋白是否參與了DDP誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)。 5.分析自噬抑制劑在DDP治療ACC-M移植瘤中的作用。 研究方法 1.MTT實驗及流式細胞儀分別檢測應(yīng)用自噬抑制劑或沉默自噬基因抑制自噬前后DDP誘導(dǎo)涎腺腺樣囊性癌細胞死亡和細胞凋亡的變化。Western blot檢測凋亡蛋白actived-caspase-3。 2.電鏡及熒光顯微鏡檢測DDP誘導(dǎo)涎腺腺樣囊性癌細胞自噬的變化。Western blot檢測自噬標志蛋白LC3。 3.Western blot檢測Bcl-2及P53-AMPK-mTOR相關(guān)蛋白。 4.構(gòu)建ACC-M移植瘤,檢測應(yīng)用自噬抑制劑前后腫瘤體積及重量的變化,免疫組化檢測實體瘤中自噬標志蛋白LC3的變化。 研究結(jié)果 1.3-MA增加DDP誘導(dǎo)涎腺腺樣囊性癌細胞死亡,同時促進癌細胞凋亡。 MTT結(jié)果顯示DDP處理ACC-M細胞的24小時IC50為11.34±0.92ugμ/mL因此,在隨后的實驗中使用,采用濃度為10μg/mL DDP處理ACC-M24小時。與對照組相比,DDP療組的ACC-M細胞活力下降了約61.02%；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)和DDP聯(lián)合治療組的細胞死亡率增加了約78.73%。3-MA組的細胞死亡率較對照組無明顯差別。 用流式細胞儀AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)染色檢測細胞凋亡；用Western blot檢測actived-caspase-3.與DDP組相比,DDP和3-MA聯(lián)合處理組的ACC-M細胞凋亡率顯著增加,從19.08%增加到約29.72%。通過Western blot檢測下游凋亡通路的capase-3的活性形式cis-Dichlorodiamineplatinum actived-caspase-3.與DDP組相比,3-MA和DDP聯(lián)合治療組中的actived-caspase-3增加了約36.36%。 3-MA是一個眾所周知的自噬抑制劑,它可抑制type I PI3K活性,而type IP13K是白噬體形成過程中必不可少的因子；DDP可誘導(dǎo)細胞自噬,這些在我們的實驗中被再次證實。我們在電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)DDP誘導(dǎo)ACC-M細胞產(chǎn)生的自噬體。為了證實3-MA可抑制順鉑誘導(dǎo)ACC-M細胞自噬,我們用GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞并檢測GFP分布。LC3是一種微管相關(guān)蛋白,是自噬體的重要組成部分。GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞己成為一個檢測自噬體有效的手段。在對照組中,觀察到ACC-M細胞胞漿中散在點狀熒光,而DDP處理的細胞表現(xiàn)出點狀熒光增加,且表達點狀熒光的細胞數(shù)明顯增加。點狀熒光增加表明自噬細胞的存在。研究發(fā)現(xiàn)DDP和3-MA聯(lián)合治療組與順鉑組相比,表達點狀熒光細胞減少了約64.29%。 LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)換成LC3-Ⅱ的程度與細胞自噬的水平正相關(guān),Western blot檢測LC3-II, LC3-II帶密度代表自噬水平。順鉑治療誘導(dǎo)ACC-M細胞LC3-Ⅱ表達,但3-MA使其表達減少約52.83%。除了LC3用作自噬的檢測外,p62/SQSTM1蛋白作為LC3和泛素化底物之間的連接,也被用于自噬的檢測。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)DDP和3-MA聯(lián)合治療組與順鉑治療組相比,p62的蛋白水平增加了約36.51%。 總體而言,順鉑(DDP)治療誘導(dǎo)了ACC-M細胞自噬,但3-MA抑制了細胞自噬和增強了DDP誘導(dǎo)ACC-M的細胞死亡,增加了caspase途徑的細胞凋亡。 2.Beclin-1siRNA促進涎腺腺樣囊性癌的細胞凋亡,增加癌細胞死亡。 Beclin-1是白噬過程中的一個關(guān)鍵的起始蛋白質(zhì)。為了更直接的觀察抑制自噬的對涎腺腺樣囊性癌細胞的影響,我們使用Beclin-1siRNA降低內(nèi)源性beclin-1的表達。轉(zhuǎn)染后24小時,Western blot檢測到干擾后ACC-M細胞中內(nèi)源性Beclin-1與對照組相比,減少了約56.60%。 此外,采用流式細胞儀AnnexinV-PE和7AAD的染色檢測細胞凋亡率和Western blot檢測actived-caspase-3。與DDP組相比,DDP和Beclin-1siRNA聯(lián)合組ACC-M細胞的凋亡率顯著增加：從18.78%增加到30.41%。此外,與DDP組相比,DDP和Beclin-1siRNA聯(lián)合組actived-caspase-3增加了35.19%。 在我們的實驗中證實了DDP誘導(dǎo)細胞自噬和Beclin-1siRNA抑制自噬。我們觀察到,與DDP組相比,DDP與Beclin-1siRNA聯(lián)合組中ACC-M自噬細胞減少了約80.32%。DDP組ACC-M細胞中LC3-Ⅱ明顯增加,但與DDP組相比,DDP和Beclin-1siRNA聯(lián)合組LC3-Ⅱ減少了約61.11%。相應(yīng)地,與DDP治療相比,DDP和Beclin-1siRNA聯(lián)合組的p62蛋白表達增加了約100%。 總體而言,順鉑(DDP)誘導(dǎo)了ACC-M細胞自噬,Beclinl siRNA抑制細胞自噬和增強了DDP誘導(dǎo)ACC-M細胞死亡,提高了caspase途徑細胞凋亡。 3.Bcl-2蛋白可能是細胞凋亡和自噬之間的聯(lián)系蛋白；P53-AMPK-mTOR信號通路可能參與了DDP誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)。 以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)DDP誘導(dǎo)的細胞凋亡和自噬之間可能有串?dāng)_,因此我們檢測了Bcl-2的表達。通過Western blot分析,我們發(fā)現(xiàn)DDP可提高ACC-M細胞中Bcl-2的表達,而Beclin-1siRNA可使增加的Bcl-2減少。因此,在我們的實驗中Bcl-2蛋白可能是自噬和凋亡途徑之間的聯(lián)系蛋白。 此外,我們探索了DDP誘導(dǎo)自噬的基本機制。通過Western blot法,我們發(fā)現(xiàn)在ACC-M細胞中DDP處理組腫瘤抑制基因P53和AMP激活的蛋白激酶(AMPK)磷酸化增加,哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)磷酸化顯著下降。 4.DDP和3-MA聯(lián)合對ACC-M移植瘤的抗癌作用。 為了進一步驗證自噬在體內(nèi)涎腺腺樣囊性癌細胞的作用,我們構(gòu)建了ACC-M裸鼠移植瘤。結(jié)果顯示各分組之間荷瘤鼠體重?zé)o顯著差異。與順鉑組及空白對照組相比,順鉑和3-MA聯(lián)合組的腫瘤生長被顯著抑制。與空白對照相比,3-MA組的腫瘤生長沒有明顯變化。30天時,與DDP組相比較,順鉑和3-MA聯(lián)合組的小鼠腫瘤體積和腫瘤重量分別顯著減少了53.64%和59.75%。免疫組織化學(xué)分析結(jié)果示DDP組移植瘤組織中LC3的表達明顯高于其他三組。這些結(jié)果表明DDP和3-MA聯(lián)合能夠抑制涎腺腺樣囊性癌細胞自噬及其移植瘤的生長。 結(jié)論 1.3-MA增加DDP誘導(dǎo)涎腺腺樣囊性癌細胞死亡,同時促進癌細胞凋亡。 2.Beclin-1siRNA促進涎腺腺樣囊性癌的細胞凋亡,增加癌細胞死亡。 3.Bcl-2蛋白可能是細胞凋亡和自噬之間的聯(lián)系蛋白；P53-AMPK-mTOR信號可能參與了DDP誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)。 4.DDP和3-MA聯(lián)合對ACC-M移植瘤的抗癌作用。 自噬是細胞內(nèi)源性途徑,它在細胞應(yīng)激和營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下可維持能量平衡和高分子合成,促進細胞存活。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是在細胞應(yīng)激和營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下生理功能的中斷導(dǎo)致未折疊蛋白的積累和誘導(dǎo)未折疊蛋白應(yīng)答的過程。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬均與人類癌癥有關(guān)。我們研究了自噬相關(guān)蛋白(LC3和Beclin1)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(GRP78)在頭頸部涎腺腺樣囊性癌組織中的表達。79例頭頸部腺樣囊性癌組織(?)組織標本制成組織微陣列芯片用于免疫組化。LC3的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.016)及TNM分期(P=.021)顯著相關(guān)。Beclin1的表達組織增長模式(P=0.002),組織學(xué)分級(P.001)及survivial (P.001)顯著相關(guān)。GRP78的表達組織增長模式(P=0.019),組織學(xué)分級(P=0.019)及survivial (P=0.001)顯著相關(guān)。LC3的表達與Beclin1的表達(P0.001)呈正相關(guān)；LC3和Beclin1的表達與GRP78的表達呈正相關(guān)(P=0.035)(P=0.008)。我們研究了在腺樣囊性癌中LC3, Beclin1和GRP78的表達及其與臨床病理因素和總生存期的關(guān)系。這些結(jié)果表明,LC3, Beclin1和GRP78可能在腺樣囊性癌腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演一個重要的角色,且Beclin1和GRP78能成為判斷涎腺腺樣囊性癌患者預(yù)后標志。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R739.8

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本文編號：2661053