【摘要】：目的： 糞腸球菌普遍具有形成生物膜的能力，根管內(nèi)的糞腸球菌主要以生物膜形式存在。糞腸球菌生物膜形成后對抗生素具有更強的抵抗性。乙二胺四乙酸（EDTA）是一種金屬螫合劑，EDTA作為常用的根管沖洗液被眾多研究者廣泛關(guān)注。最新研究證明EDTA具有一定的抗菌及抗生物膜的活性，可與多種抗生素聯(lián)合使用達(dá)到協(xié)同抗菌和有效清除細(xì)菌生物膜的目的[1-5]。洗必泰又稱醋酸氯已定，一種廣譜抗生素，也是臨床上常用的根管沖洗液。本實驗研究通過在體外環(huán)境下檢測EDTA聯(lián)合洗必泰對糞腸球菌及其生物膜的抗菌效果及清除效果，評價二者是否具有協(xié)同抗菌和清除生物膜作用，旨在為臨床上更加有效地控制糞腸球菌感染，提高根管治療成功率提供理論依據(jù)。 方法： 1、采用二倍稀釋法分別測定EDTA、洗必泰對糞腸球菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)，然后采用微量棋盤稀釋法[6]并通過計算分級抑制濃度指數(shù)(FICI)來評價EDTA與洗必泰是否具有協(xié)同抗菌的作用。FICI=(MICa聯(lián)合/MICa單藥)+(MICb聯(lián)合/MICb單藥)。FICI≤0.5為協(xié)同；FICI4.0為拮抗；0.5FICI≤4為相加。 2、在96孔板上建立糞腸球菌24h成熟生物膜模型。用BHI培養(yǎng)基把17%EDTA溶液稀釋成6種不同濃度并分6組，A1組(1MIC EDTA)、B1組(2MICEDTA)、 C1組(4MIC EDTA)、D1組(8MIC EDTA)、E1組(16MIC EDTA)、F1組(32MIC EDTA)，設(shè)G1組為陰性對照組，采用MTT法檢測各組作用24小時糞腸球菌生物膜后的吸光度值，比較各組之間的差異。不同濃度EDTA聯(lián)合洗必泰分為6組，A2組（1MIC EDTA+0.002%洗必泰）、B2組（2MICEDTA+0.002%洗必泰）、C2組(4MIC EDTA+0.002%洗必泰)、D2組(8MICEDTA+0.002%洗必泰)、E2組(16MIC EDTA+0.002洗必泰)、F2組(32MICEDTA+0.002洗必泰)，設(shè)G2組為陽性對照組（BHI培養(yǎng)基+0.002%洗必泰）、H2組為陰性對照組（BHI培養(yǎng)），采用MTT法檢測各組作用24小時糞腸球菌生物膜后的吸光度值，比較各組之間的差異。 3、在蓋玻片上建立糞腸球菌24h成熟生物膜模型，生物膜分別經(jīng)EDTA、洗必泰或二者聯(lián)合作用24h后，經(jīng)熒光染色后置于激光共聚焦顯微鏡（CLSM）下觀察生物膜中細(xì)菌染色情況及細(xì)菌數(shù)量變化。設(shè)陰性對照組。 結(jié)果： 1、EDTA的MIC值為5.3125mg/ml。MBC值暫未測到。洗必泰的MIC值為0.00125mg/ml，MBC值為0.005mg/ml。經(jīng)微量棋盤測定法測的EDTA聯(lián)合洗必泰的最小抑菌濃度：EDTA（聯(lián)合）濃度為1.328125mg/ml，洗必泰（聯(lián)合）濃度為4.88×10~(－7)mg/ml，， FICI值為0.250976。 2、經(jīng)藥物作用24小時糞腸球菌生物膜后的吸光度值中，A1、B1、C1、D1、E1、F1和G1組7組之間差異無顯著性（P0.05）；聯(lián)合用藥各組（A2組、B2組、C2組、D2組、E2組、F2組）與G2組（陽性對照組）比較差異有顯著性(P0.05)，與H2（陰性對照組）比較差異有顯著性(P0.05)，而A2、B2、C2、D2、E2、F2各組之間差異無顯著性（P0.05）。 3、激光共聚焦顯微鏡（CLSM）圖像顯示：EDTA組于CLSM下可見生物膜中細(xì)菌密集，鏡下視野中菌體染色以綠色熒光為主，僅少量菌體染色為紅色熒光，同一視野疊加后，以綠色熒光為主（圖10）；洗必泰組于CLSM下可見生物膜中細(xì)菌數(shù)量減少，鏡下視野中菌體染色呈綠色熒光者比例減少，而紅色熒光比例增加，圖像疊加后呈現(xiàn)黃色或桔色，部分區(qū)域為深紅色（圖11）；EDTA聯(lián)合洗必泰組，生物膜中細(xì)菌數(shù)量減少，鏡下視野中絕大多數(shù)為呈紅色熒光染色的菌體，僅有少量綠色熒光菌體呈零星散在分布，圖像疊加后絕大多數(shù)為紅色熒光染色菌體（圖12）；陰性對照組可見成熟生物膜細(xì)菌密集、層疊，鏡下視野中菌體染色以綠色熒光染色者占絕大多數(shù)，圖像疊加后以綠色熒光為主(圖9)。 結(jié)論： 1、EDTA對糞腸球菌具有一定的抑菌作用，而無殺菌作用。 2、EDTA聯(lián)合洗必泰對懸浮狀態(tài)下的糞腸球菌具有協(xié)同抗菌作用。 3、EDTA對糞腸球菌生物膜無明顯作用。 4、EDTA聯(lián)合洗必泰對糞腸球菌生物膜的作用效果優(yōu)于洗必泰單獨使用，顯示二者聯(lián)合具有較強的抗生物膜作用。
【圖文】：

XH-B型漩渦混合器和全自動酶標(biāo)儀

圖2分裝好的5mg/ml的MTT
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R781.05

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2660174