【摘要】： 1、背景 細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1,CD54)屬免疫球蛋白基因超家族,它通過介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間,細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的粘附作用,參與一系列生理及病理過程。ICAM-1為單鏈跨膜糖蛋白,分子量80-110KDa,由5個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域的胞外區(qū)、疏水跨膜區(qū)和胞質(zhì)短尾組成。人ICAM-1基因DNA包含7個(gè)外顯子、6個(gè)內(nèi)含子、一個(gè)上游調(diào)控區(qū)、一個(gè)3p非編碼區(qū),調(diào)控區(qū)內(nèi)有IFN反應(yīng)元件、糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合位點(diǎn)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)結(jié)合位點(diǎn)、活化劑蛋白-1(AP-1)反應(yīng)元件等,信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT)、NF-κB、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(Ets)等轉(zhuǎn)錄因子可分別與這些元件結(jié)合而影響該基因的轉(zhuǎn)錄。其中NF-κB在激活啟動中起主要作用,NF-κB通過特異性的蛋白-蛋白的相互作用,同其他轉(zhuǎn)錄因子和共激活因子一起參與ICAM-1的表達(dá)調(diào)節(jié)。 目前發(fā)現(xiàn)的ICAM-1的受體有兩個(gè),淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-I(LFA-1)和β2-整合素amb2(Mac-1),均屬整合素家族。靜息狀態(tài)下ICAM與LFA-1的親和力很低,為10~5-10~6M左右。靜息的親和力在調(diào)節(jié)LFA-1后可增高:一是整合素在膜上的分布,增加了聚集的程度可使親和力增加;另是整合素構(gòu)型的改變,使與其配體連接的內(nèi)在親和力增高。 ICAM-1分布廣泛,在大多數(shù)組織,ICAM-1的表達(dá)是低水平的。生理情況下,這種低水平表達(dá)為細(xì)胞識別、激活、增殖、分化、運(yùn)動提供了潛在的分子基礎(chǔ),幫助機(jī)體建立穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境。此外,ICAM-1在病理情況下也充當(dāng)了重要的角色,尤其是炎癥反應(yīng)。ICAM-1可受許多因素的誘導(dǎo)而上調(diào),如細(xì)胞因子(IL-1,IL-2,IL-6和TNF-α等),其他炎癥介質(zhì)如血小板激活因子(PAF)等,均可使ICAM-1增多。因此,對ICAM-1廣泛而客觀的研究是極其必要的。 有研究認(rèn)為白細(xì)胞從體循環(huán)遷移至炎癥部位包含一系列過程:在炎癥時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞表面的選擇素(E選擇素和P選擇素)和粘蛋白(可與L選擇素結(jié)合)表達(dá)快速增加,而選擇素和糖類的結(jié)合又可介導(dǎo)白細(xì)胞“聚合(tethering)和滾動(rolling)”,使循環(huán)中快速移動的白細(xì)胞變慢并與內(nèi)皮細(xì)胞松散結(jié)合;接著內(nèi)皮或間質(zhì)釋放趨化因子而導(dǎo)致白細(xì)胞表面的整合素(如LFA-1和Mac-1)親和力增加。這些整合素與其在受刺激的內(nèi)皮細(xì)胞上的配體(ICAM-1,ICAM-2和VCAM-1)結(jié)合后,可導(dǎo)致白細(xì)胞被捕獲和粘附在內(nèi)皮細(xì)胞表面。最后,由于白細(xì)胞表面的整合素和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白相互作用,而使粘附反應(yīng)擴(kuò)大,并促使白細(xì)胞穿越內(nèi)皮到達(dá)炎癥部位。而根據(jù)我們文獻(xiàn)學(xué)習(xí)中發(fā)現(xiàn),ICAM-1既在細(xì)胞粘附中起著重要作用,在白細(xì)胞的跨內(nèi)皮移行中亦不可缺少。 2、目的 牙髓被周圍硬組織包圍,僅通過根尖孔和副根尖孔與周圍組織聯(lián)系,形成一種相對獨(dú)立的組織架構(gòu)。同時(shí)也形成了其獨(dú)特的生理特點(diǎn):也就是牙髓對任何的傷害或刺激均以牙髓的炎癥來反應(yīng)。這是其基本的生物防御機(jī)制。而在臨床上,牙髓也可以因?yàn)檠荔w硬組織齲病或牙周炎癥而長期暴露于炎癥刺激之下,而我們應(yīng)對的診斷和治療方式是較為單一的。這就需要我們對牙髓的炎癥過程和機(jī)理進(jìn)行深入的研究。 相對應(yīng)其他組織及疾病中ICAM-1較為廣泛的關(guān)注以及相對明確的運(yùn)作機(jī)理研究,在牙髓中ICAM-1的研究是較為局限的。因此我們采用機(jī)械暴露大鼠牙髓并曠置口腔,通過口腔菌群的自然感染來誘導(dǎo)牙髓炎,在此模型基礎(chǔ)上,通過免疫組化及圖像分析技術(shù)觀察實(shí)驗(yàn)性牙髓炎發(fā)生、發(fā)展中ICAM-1的表達(dá),初步探討ICAM-1在實(shí)驗(yàn)性牙髓炎發(fā)生、發(fā)展全過程中的作用。 3、材料與方法 3.1分組及建立大鼠實(shí)驗(yàn)性牙髓炎模型 SD大鼠60只隨機(jī)分為6組,每組10只。A組對照組:不做任何處理;實(shí)驗(yàn)組:根據(jù)處理時(shí)間,B組牙髓炎1小時(shí)、C組牙髓炎1天、D組牙髓炎3天、E組牙髓炎5天、F組牙髓炎7天。實(shí)驗(yàn)組大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后用005號小球鉆將右側(cè)上頜第一、第二磨牙牙合面開髓,深度能探及一細(xì)小的穿髓點(diǎn),將髓腔直接暴露于口腔環(huán)境中。 3.2標(biāo)本制備 按上述分組分別處死動物,取右側(cè)上頜磨牙固定,常規(guī)脫鈣,常規(guī)脫水、石蠟包埋,沿牙齒頰舌向過窩洞自冠部到根尖部作厚度約為5μm的連續(xù)切片。 3.3組織學(xué)觀察 HE染色后光鏡下觀察,檢驗(yàn)組織形態(tài)學(xué)變化。 3.4免疫組化染色 SP法:石蠟切片37℃烘片過夜,脫蠟,蒸餾水沖洗。3%H_2O_2,室溫濕盒10分鐘阻斷內(nèi)源性氧化物酶,蒸餾水沖洗,PBS沖洗3次。微波抗原修復(fù),滴加10%非免疫血清,室溫濕盒15分鐘,吸干,勿洗。滴加ICAM-1單抗,4℃冰箱濕盒過夜,PBS沖洗3次。滴加生物素標(biāo)記的二抗,37℃濕盒15分鐘PBS沖洗3次,滴加鏈霉素抗生素蛋白-氧化物酶,37℃濕盒10分鐘PBS沖洗3次。DAB顯色劑顯色,流水沖洗,復(fù)染,脫水透明,封片。實(shí)驗(yàn)中用PBS代替一抗作陰性對照。 3.5 ICAM-1表達(dá)的測量 選取同一染色條件的不同位點(diǎn)切片,應(yīng)用日本Olympus光學(xué)顯微鏡,日本JVC ky-F30B 3-CCD彩色圖像攝錄輸入儀,美國MediaCybernetics公司Image ProPluss 5.0圖像分析系統(tǒng)。每只動物選取四張切片,每張切片上選擇三個(gè)視野,高倍鏡下(×40)攝片,測量照片中的面積、累積光密度值和平均光密度值,并取均數(shù)作為每只動物的平均光密度值(0D)。 3.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以(?)±s表示,采用SPSS 13.0軟件分析。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較采用最小差異(least significantdifference,LSD)t檢驗(yàn),以P＜0.05為有顯著性差異。 4、結(jié)果 4.1組織學(xué)變化 正常大鼠牙髓:牙髓組織內(nèi)有少量血管和大量分布的成纖維細(xì)胞,在牙髓和牙本質(zhì)交界處的髓腔內(nèi)側(cè)有一層柱狀排列的成牙本質(zhì)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組大鼠均出現(xiàn)了典型的牙髓炎表現(xiàn)。牙髓炎癥可在1小時(shí)組出現(xiàn),并隨時(shí)間發(fā)展逐漸加重。中性粒細(xì)胞出現(xiàn)較早,逐漸增多;淋巴細(xì)胞在牙髓炎第三天開始出現(xiàn),5至7天逐漸增多。血管增生和擴(kuò)張、充血也是牙髓炎癥的主要表現(xiàn)。 4.2免疫組化染色結(jié)果 對照組正常大鼠牙髓組織中:ICAM-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中為弱陽性表達(dá)。大鼠牙髓炎癥1小時(shí)組:ICAM-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中為陽性表達(dá)。大鼠牙髓炎1天組:ICAM-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中為強(qiáng)陽性表達(dá),在炎性細(xì)胞中也有強(qiáng)陽性染色,故牙髓血管呈環(huán)行著色。大鼠牙髓炎3天組:ICAM-1免疫染色與牙髓炎1天組相接近。大鼠牙髓炎5天組:上述陽性ICAM-1染色程度開始下降,但血管內(nèi)皮細(xì)胞染色仍呈強(qiáng)陽性。大鼠牙髓炎7天組:上述ICAM-1陽性染色程度進(jìn)一步下降,但比正常大鼠牙髓組織染色略強(qiáng)。 4.3圖象及統(tǒng)計(jì)分析 采用單因素方差對多組間比較發(fā)現(xiàn)各組之間有差異:F=10.692,P＜0.001。采用LSD法進(jìn)行組間兩兩比較發(fā)現(xiàn):對照組(A)ICAM-1光密度值與牙髓炎各組比均較有差異;牙髓炎1小時(shí)組(B)與牙髓炎1天組(C)、牙髓炎3天組(D)、牙髓炎5天組(E)有差異;牙髓炎7天組(F)與牙髓炎1天、3天、5天組有差異,與牙髓炎1小時(shí)組未見差異。 5、結(jié)論 牙髓暴露法可以成功建立牙髓炎模型,通過此模型可以動態(tài)的觀察牙髓炎癥的完整過程,對正常牙髓、急性炎癥牙髓、慢性炎癥牙髓做出對比。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在正常大鼠牙髓血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1有弱陽性表達(dá)。在大鼠牙髓炎發(fā)生后1小時(shí)ICAM-1表達(dá)上調(diào)即已出現(xiàn),雖然表達(dá)較低,但仍表明牙髓炎癥初始ICAM-1即參與其中。隨著時(shí)間發(fā)展ICAM-1表達(dá)增強(qiáng),1天既已達(dá)到高峰,3至5天維持較高水平,7天時(shí)降至牙髓炎初始時(shí)水平。 本實(shí)驗(yàn)雖未對白細(xì)胞進(jìn)行客觀的計(jì)量,但通過常規(guī)的病理知識結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的組織學(xué)觀察,可以明確中性粒細(xì)胞在急性炎癥期牙髓中明顯增多,慢性炎癥期(7天組)逐漸減少,這與ICAM-1的表達(dá)結(jié)果相對應(yīng),提示了ICAM-1在牙髓炎中促使中性粒細(xì)胞粘附和跨內(nèi)皮移行的作用。但是,在本實(shí)驗(yàn)中淋巴細(xì)胞和ICAM-1的表達(dá)并不同步,當(dāng)淋巴細(xì)胞逐漸增多時(shí)(5天組到7天組),ICAM-1的表達(dá)卻呈現(xiàn)下降趨勢,這表明牙髓炎中ICAM-1對淋巴細(xì)胞的粘附和跨皮移行作用并不顯著。還應(yīng)該有其他的淋巴細(xì)胞介導(dǎo)方式。 在牙髓炎的研究中,盡管有學(xué)者研究了在人正常牙髓、慢性牙髓炎和急性牙髓炎牙髓組織中ICAM-1的表達(dá),但我們在動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕系膶?shí)驗(yàn)?zāi)康氖?在細(xì)胞分子水平上動態(tài)的觀察牙髓炎癥發(fā)生、發(fā)展的全過程,進(jìn)一步明確ICAM-1在參與牙髓炎發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)理。
【圖文】：

Fig3一2一 l:Theratwasfixedonthebenehafteranesthesia.圖3一2一2:口內(nèi)操作，，開髓Fig3一2一 2:OPerationintheoral.PulPexP0sure·圖3一2一3:開髓后上領(lǐng)第一磨牙(箭頭所指)Fig3一2一 3:Therightfirsttna勸 llarymolarteeth afterPulPexPosure.(arrowhead)圖3一2一4:標(biāo)本浸泡固定及脫鈣Fig3一2一 4:SPeeimensweresoakedforfixation汕 ddeealeifieation.

第一部分大鼠牙髓炎模型的建立和觀察圖3一2一1:大鼠麻醉后固定于實(shí)驗(yàn)臺上Fig3一2一 l:Theratwasfixedonthebenehafteranesthesia.圖3一2一2:口內(nèi)操作，開髓Fig3一2一 2:OPerationintheoral.PulPexP0sure·圖3一2一3:開髓后上領(lǐng)第一磨牙(箭頭所指)Fig3一2一 3:Therightfirsttna勸 llarymolarteeth afterPulPexPosure.(arrowhead)圖3一2一4:標(biāo)本浸泡固定及脫鈣Fig3一2一 4:SPeeimensweresoakedforfixation汕 ddeealeifieation.
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R781.3

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本文編號：2658084