【摘要】：目的 本研究通過抑制消減雜交技術(shù)(Supression Subtractive Hybridization,SSH)對比牙齦卟啉單胞菌高毒力株W83與低毒力株標(biāo)準(zhǔn)參考菌ATCC33277的基因差異,建立差異消減文庫,經(jīng)PCR篩選鑒定陽性克隆,進而對部分片段進行測序和同源分析。從全基因角度研究牙齦卟啉單胞菌高毒株W83與標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 33277之間的分子遺傳差異。同時結(jié)合基因芯片技術(shù)對臨床患者口腔中牙齦卟啉單胞菌進行篩查,可以為牙齦卟啉單胞菌致病基因的篩選提供依據(jù),為今后牙周病預(yù)防、診治的靶標(biāo)提供理論依據(jù)。 材料與方法 1.研究對象的選擇:實驗組選擇慢性牙周炎者50例,對照組選擇牙周健康,年齡,性別與實驗組具可比性者20例。所有受試者均無全身系統(tǒng)性疾病,未接受牙周系統(tǒng)治療,近3個月未服用抗生素,無吸煙史,知情同意。 2.記錄牙周指數(shù):所有檢查內(nèi)容均由同一檢查者完成。選擇牙周炎患者口腔中病變較重的部位與健康或僅存在輕度齦炎的部位、牙周健康者的健康部位,記錄探診出血指數(shù)(Bleeding on Probing,BOP),牙周探診深度(Probing Depth,PD),臨床附著喪失(Clinical Attachment Loss,CAL)及牙齒松動度(Tooth Movement,TM)。 3.樣本采集及細(xì)菌培養(yǎng):用滅菌齦下刮治器取被檢牙位齦下菌斑,置于轉(zhuǎn)送液(TD液)中10倍稀釋后立即接種于BHI培養(yǎng)基上培養(yǎng),經(jīng)分離、傳代、固體液體增菌、生化鑒定后收集菌體。 4.Porphyromonas gingivalis的檢測:用試劑盒提取DNA,用P.gingivalis 16S rRNA特異引物PCR擴增,1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
【圖文】：

幾al酶切后的W83基因組DNA(tester)和ATcC33277株基因組DNA電泳圖片顯示呈現(xiàn)smaer狀條帶，范圍在0.1一2場之間，符合本實驗要求，如圖1所示。M:l加bPDNA腸dderMa政er圖1;1:W83DNA酶切后;2:ATCC33277DNA酶切后Rasl酶切后的電泳結(jié)果二、SSH結(jié)果1、接頭連接效率檢測:如圖2所示，在2、4泳道擴增出大小在400-soobp的片段，經(jīng)Blast分析，輸人尸.夢ngi二115特異性引物上游，剪貼一段尸.9￡ng初alsi基因序列，通過NEBCutter查找離上游引物最近的Rsal酶

2、消減及PcR結(jié)果:上述RSal酶切的etster分別與daaptorl和daPaotrZR連接產(chǎn)物與變性driver進行2輪消減和2輪CPR得到消減CPR混和物。如圖3所示，，消減之前的etsterPcR產(chǎn)物和消減后的PcR產(chǎn)物電泳圖譜帶型明顯不同。后者的差異強化帶代表etster獨有而driver缺如的片段。M:loobpDNAI』dderM毗er;1:第一次PCR產(chǎn)物2:第二次PCR產(chǎn)物圖3消減后的PcR產(chǎn)物電泳圖3、消減效率檢測按照操作程序進行消減效率分析，結(jié)果見圖4。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R780.2

【參考文獻】

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本文編號：2657203