【摘要】： 正畸牙齒移動(dòng)的生物學(xué)基礎(chǔ)是牙周組織主導(dǎo)的骨吸收和骨形成活動(dòng)。牙周膜細(xì)胞是正畸力的直接效應(yīng)細(xì)胞,是一組有異質(zhì)性的細(xì)胞群,其中的一些細(xì)胞可以分化為成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞,同時(shí)牙周膜成纖維細(xì)胞還可以通過(guò)表達(dá)骨保護(hù)因子(osteoprotegerin,OPG)和破骨細(xì)胞分化因子(receptor activatornuclear factor kappa B ligand,RANKL)來(lái)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的活動(dòng)。成骨/基質(zhì)細(xì)胞與前體破骨細(xì)胞(osteoclast precursors,OCP)的直接接觸是破骨細(xì)胞(osteoclast,OC)形成、分化過(guò)程中必不可少的因素之一,而且骨吸收刺激因子作用于成骨/基質(zhì)細(xì)胞后,其產(chǎn)生RANKL與前體破骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞膜上表達(dá)的RANKL受體(receptor activator of nuclear factor-κB receptor,RANK)結(jié)合,引起級(jí)聯(lián)反應(yīng),使破骨細(xì)胞分化、成熟、激活,并促進(jìn)其從骨膜釋放、轉(zhuǎn)移、粘附到骨質(zhì)表面。除了RANKL,成骨/基質(zhì)細(xì)胞還生成與之對(duì)應(yīng)的OPG,可競(jìng)爭(zhēng)性地與RANK結(jié)合,以封閉RANKL與RANK的結(jié)合,抑制破骨細(xì)胞的分化成熟,抑制骨吸收功能。 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族,是誘導(dǎo)成骨活性最強(qiáng)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)之一,可促進(jìn)牙槽骨、牙骨質(zhì)和牙周韌帶的再生。國(guó)外學(xué)者研究認(rèn)為,BMP-2具有誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化和活化骨吸收功能的作用,并且通過(guò)RANKL/OPG途徑誘導(dǎo)成骨/基質(zhì)細(xì)胞參與破骨細(xì)胞的活化,但是國(guó)內(nèi)關(guān)于BMP-2對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞參與的破骨細(xì)胞活化的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。 牙周膜細(xì)胞是正畸施力后的主要效應(yīng)細(xì)胞,在壓力和張力的作用下,牙槽骨同時(shí)開(kāi)始骨吸收和骨形成的骨改建過(guò)程,BMP-2同時(shí)具有成骨和誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的作用,明確其對(duì)牙周膜細(xì)胞的作用對(duì)于了解正畸牙齒的移動(dòng)速度、矯治的效率、牙槽骨的改建以及矯治結(jié)束后的穩(wěn)定性均有重要意義。 本實(shí)驗(yàn)在體外將分離培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontalligament fibroblasts,PDLFs)和從人全血中分離出的單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral BloodMononuclear Cells,PBMCs)進(jìn)行直接共培養(yǎng),探討重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(recombinant human BMP-2,rhBMP-2)和人牙周膜成纖維細(xì)胞在破骨樣細(xì)胞形成中的作用;探索體外分離培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細(xì)胞OPG和RANKL的表達(dá),并探討rhBMP-2對(duì)其表達(dá)的影響。本研究將實(shí)驗(yàn)分為以下兩部分: 一、rhBMP-2和人牙周膜成纖維細(xì)胞對(duì)體外誘導(dǎo)破骨樣細(xì)胞生成的影響 目的 (1)建立人牙周膜成纖維細(xì)胞和人外周血中單個(gè)核細(xì)胞的直接共培養(yǎng)模型,觀察人牙周膜成纖維細(xì)胞在破骨樣細(xì)胞誘導(dǎo)形成過(guò)程中的作用; (2)觀察rhBMP-2對(duì)TRAP(tartrate-resistant acidic phosphatase)陽(yáng)性單個(gè)核細(xì)胞和TRAP陽(yáng)性多核破骨樣細(xì)胞形成的影響; (3)探討rhBMP-2和人牙周膜成纖維細(xì)胞對(duì)破骨樣細(xì)胞誘導(dǎo)形成的影響及其可能的作用機(jī)制。 方法 組織塊法體外常規(guī)培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞,同時(shí)利用Ficoll-Paque Plus淋巴分離液分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞。在含有1×10~8mol/L 1α,25-(OH)_2D_3與1×10~(-7)mol/L地塞米松的培養(yǎng)液中,將單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)或與牙周膜成纖維細(xì)胞直接共培養(yǎng)18天,同時(shí)設(shè)置rhBMP-2(+)和rhBMP-2(-)組,以后每3天進(jìn)行換液,每次半換液,觀察TRAP陽(yáng)性單個(gè)核細(xì)胞和TRAP陽(yáng)性多核破骨樣細(xì)胞的數(shù)量,并且分析rhBMP-2和人牙周膜成纖維細(xì)胞對(duì)其影響。 結(jié)果 (1)通過(guò)TRAP染色法和牙本質(zhì)上的骨吸收陷窩證明了人牙周膜成纖維細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞直接共培養(yǎng)誘導(dǎo)破骨樣細(xì)胞的模型是可行的; (2)共培養(yǎng)體系中,rhBMP-2(+)組與rhBMP-2(-)組的TRAP陽(yáng)性多核細(xì)胞數(shù)目相比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=71.070,P＜0.001);共培養(yǎng)組與單個(gè)核細(xì)胞組之間的TRAP陽(yáng)性多核細(xì)胞數(shù)目相比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=39.000,P＜0.001);共培養(yǎng)組受rhBMP-2誘導(dǎo)后,TRAP陽(yáng)性多核細(xì)胞數(shù)目顯著增加(t=17.079,P＜0.001); (3)rhBMP-2與人牙周膜成纖維細(xì)胞在TRAP陽(yáng)性多核細(xì)胞的形成中發(fā)揮重要作用;同時(shí),rhBMP-2與人牙周膜成纖維細(xì)胞聯(lián)合作用能促進(jìn)TRAP陽(yáng)性多核細(xì)胞的生成。 結(jié)論: (1)在與人牙周膜成纖維細(xì)胞直接共培養(yǎng)的前提下,人外周血單個(gè)核細(xì)胞可分化為TRAP陽(yáng)性的破骨樣細(xì)胞; (2)rhBMP-2有促進(jìn)破骨樣細(xì)胞生成的作用,其作用機(jī)制可能是通過(guò)人牙周膜成纖維細(xì)胞間接作用于人外周血單個(gè)核細(xì)胞。 二、人牙周膜成纖維細(xì)胞OPG和RANKL的表達(dá)以及rhBMP-2對(duì)其表達(dá)的影響 目的 (1)檢測(cè)人牙周膜成纖維細(xì)胞OPG和RANKL在基因水平和蛋白水平的表達(dá); (2)觀察rhBMP-2對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞中OPG和RANKL蛋白表達(dá)的影響,從而探討rhBMP-2對(duì)破骨樣細(xì)胞生成的作用機(jī)制。 方法 采用組織塊法體外培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞,選取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的細(xì)胞,利用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)正�；A(chǔ)狀態(tài)下,人牙周膜成纖維細(xì)胞上RANKL蛋白的表達(dá),以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)OPG蛋白的表達(dá)。然后利用100ng/mlrhBMP-2對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo),分別于誘導(dǎo)3d、6d、9d、12d、15d、18d時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清,檢測(cè)分泌型OPG蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果 (1)人牙周膜成纖維細(xì)胞膜上和胞漿中表達(dá)RANKL蛋白,符合其跨膜蛋白的特征;同時(shí)也分泌OPG蛋白到培養(yǎng)液中; (2)在18天的誘導(dǎo)周期中,雖然OPG蛋白的分泌量由于細(xì)胞增殖呈升高趨勢(shì),但rhBMP-2(+)組的增長(zhǎng)趨勢(shì)低于rhBMP-2(-),說(shuō)明rhBMP-2的誘導(dǎo)可顯著減少OPG蛋白的分泌(F=45.433,P＜0.001)。 結(jié)論: (1)在正常的基礎(chǔ)狀態(tài)下,人牙周膜成纖維細(xì)胞能可表達(dá)OPG和RANKL; (2)rhBMP-2的誘導(dǎo)影響OPG蛋白的表達(dá),推測(cè)其可能通過(guò)OPG/RANKL通路來(lái)影響人牙周膜成纖維細(xì)胞參與的破骨樣細(xì)胞的活化。
【圖文】：

1.2.1人牙周膜成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定倒置相差顯微鏡下觀察:組織塊接種5~8d后，可見(jiàn)有細(xì)胞從組織塊旁游離出來(lái)，呈典型細(xì)長(zhǎng)梭形、短梭形或三角形等(圖1一1所示)。接種20d后細(xì)胞爬滿瓶底(圖1一2所示)。圖1一1人牙周膜成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)5d，細(xì)胞開(kāi)始游離出來(lái)舊ar=loo阿)F論1一卜P面山叼H.叮anPDLFscu】加葉刃forsdays，theeelhbegangrowing毋。100阿)

(B護(hù)100林m)人牙周膜成纖維細(xì)胞的免疫組化鑒定:人牙周膜成纖維細(xì)胞波形絲蛋白染色陽(yáng)性(細(xì)胞胞漿棕黃色)，，角蛋白陰性，說(shuō)明所培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)源于中胚層(圖1一3和1一所示)。偽、\·、，的嗽認(rèn)找飛一‘“了廠萬(wàn)‘爭(zhēng)‘..卜/‘r夕-卜.日于八了/圖l一3人牙周膜成纖維細(xì)胞波形絲蛋白染色陽(yáng)性，細(xì)胞漿呈棕黃色(B二100卿)Figl一 3:ThePositiveexPn污 sionofvimentininHumanPDLFs(B二100冬田1)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R783.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 張丁,楊雁琪,李小彤,傅民魁;人牙周膜細(xì)胞骨保護(hù)因子和破骨細(xì)胞分化因子蛋白的表達(dá)及1α,25(OH)_2維生素D_3的調(diào)節(jié)[J];北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2004年06期

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本文編號(hào)：2655881