【摘要】：目的：健康人來源的牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)是牙周組織中的成體干細胞,具有自我更新能力和多項分化潛能,國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn)篩選的牙周膜干細胞可分別形成骨樣結(jié)構(gòu)(體外誘導)和成牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)(動物體內(nèi)實驗)。但是2型糖尿病伴牙周炎狀態(tài)下的PDLSC自我更新能力和多項分化能力的研究并未見報道,本實驗擬從基因、蛋白水平觀察2型糖尿病患者PLDSCs多項分化能力。通過體外擴增培養(yǎng)正常人、牙周炎患者和2型糖尿病伴牙周炎患者牙周膜成纖維細胞,經(jīng)過篩選和鑒定PDLSC,比較體外培養(yǎng)的正常人牙周膜干細胞(H-PDLSC)、牙周炎患者牙周膜干細胞(P-PDLSC)和糖尿病伴牙周炎患者牙周膜干細胞(D-PDLSC)自我更新和成骨成脂分化的能力,進而從PDLSC的功能變化解釋2型糖尿病患者牙周炎患病率高的臨床現(xiàn)象。 方法：本實驗采用體外組織塊法體外培養(yǎng)正常人、牙周炎患者和2型糖尿病伴牙周炎患者前磨牙或第三磨牙牙周膜成纖維細胞,通過有限稀釋法分別篩選PDLSCs,即原代細胞低密度接種后待克隆細胞增殖到孔底80%后胰酶消化并常規(guī)培養(yǎng),通過計算克隆形成率、免疫熒光細胞化學、流式細胞技術(shù)檢測細胞表型分子對PDLSCs進行初步干細胞鑒定；MTT法、流式細胞周期檢測比較H-PDLSC、P-PDLSC和D-PDLSC增值能力；利用成骨、成脂誘導液分別對三組干細胞進行成骨、成脂誘導21天,茜素紅、油紅O染色觀察鈣化結(jié)節(jié)、脂滴形成情況；連續(xù)9天觀察三組干細胞成骨誘導期間ALP活性；實時定量聚合酶鏈反應(real time PCR, RT-PCR)檢測誘導7天后的成骨基因(ALP、RUNX-2、BSP、OCN、Col-1)和成脂基因(LPL、PPAR)表達,同時利用Western Blot技術(shù)進一步驗證RT-PCR結(jié)果。 結(jié)果：(1)干細胞的分離與初步鑒定：成功培養(yǎng)H-PDLSC 10例,P-PDLSC 7例,D-PDLSC 3例,有限稀釋法篩選的PDLSCs細胞形態(tài)并無明顯差異,均呈長梭形、胞體豐滿的成纖維樣細胞；免疫熒光細胞檢測發(fā)現(xiàn),三組干細胞波形絲蛋白均陽性表達,細胞角蛋白陰性表達；同時標記細胞表型分子CD146和STRO-1,經(jīng)Image-Pro Plus軟件分析D-PDLSC表型分子CD146和STRO-1陽性細胞量表達較P-PDLSC和H-PDLSC低(P0.05),STRO-1陽性細胞百分比分別為：62.6±1.6%(H-PLDSC)、40.6±2.5%(P-PDLSC)和27.2±1.6%(D-PDLSC),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；CD146陽性細胞百分比分別為：69.6±3.4%(H-PLDSC)、48.9±1.6%(P-PDLSC)和32.1±0.9 %(D-PDLSC),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),同時經(jīng)流式細胞技術(shù)檢測CD14、CD34、CD29、CD90和STRO-1等表型分子進一步確認了干細胞的來源及其干細胞特性。 (2)干細胞自我更新和增值能力比較：H-PDLSC、P-PDLSC和D-PDLSC具有一定的自我更新能力,克隆形成率分別為：36.8±4.9%、25.0±2.3%和17.8±2.1%, D-PDLSC克隆形成率較P-PDLSC(P0.05)和H-PDLSC均低(P0.001),差異有統(tǒng)計學意義；MTT法連續(xù)七天對三種細胞增值情況比較得出,相同培養(yǎng)條件下,D-PDLSC增值能力較P-PDLSC和H-PDLSC均弱,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),同時通過對三種細胞進行流式細胞周期檢測,發(fā)現(xiàn)D-PDLSC的S+M期和G2/G1期細胞數(shù)量較少,進一步證實了D-PDLSC細胞增殖能力較P-PDLSC和H-PDLSC弱。 (3)成骨成脂分化誘導能力比較：成骨成脂誘導液分別對三組干細胞誘導21天,經(jīng)Image-Pro Plus軟件分析,發(fā)現(xiàn)相同視野下,H-PDLSC誘導后鈣化結(jié)節(jié)和脂滴面積形成最多,P-PDLSC次之,D-PDLSC最少；另外,通過RT-PCR檢測誘導一周后的RUNX-2、ALP、BSP、OCN和Col-1成骨基因和PPAR y.LPL成脂基因,發(fā)現(xiàn)D-PDLSC成骨、成脂相關(guān)基因的表達均低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。同時Western Blot技術(shù)驗證了RT-PCR結(jié)果。 (4) H-PDLSC、P-PDLSC和D-PDLSC炎性因子檢測：誘導前通過RT-PCR技術(shù)比較三組干細胞炎性因子IL-6和TNF-α表達情況。結(jié)果顯示,與H-PDLSC比較,D-PDLSC IL-6和TNF-α表達最高,P-PDLSC次之,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論：本實驗首次從糖尿病伴牙周炎患者中成功提取牙周膜干細胞,并且通過干細胞鑒定,雖然與H-PDLSC和P-PDLSC比,D-PDLSC細胞形態(tài)并無明顯的差別,但在特異性干細胞表型分子表達和干細胞的自我更新方面,同時也證明了,D-PDLSC與H-PDLSC—樣,具有干細胞特性；通過對三種干細胞成骨、成脂方向誘導結(jié)果分析,可以從干細胞的角度可以初步解釋臨床上2型糖尿病患者牙周病患病率高、病變嚴重的原因：可能是2型糖尿病狀態(tài)通過降低牙周膜干細胞的自我更新和分化能力,從而加速了牙周組織的破壞,特別是阻礙或抑制牙周膜新附著的形成和牙周膜干細胞向牙槽骨分化,導致牙周袋的形成。
【圖文】：

波形絲蛋自(A，，H一pDLSC;B，p一PDLSC:C，D一PDLSe鄧11性表達、角蛋白(D，H一poLsC;E，P一PoL5e;F，D一PoLse)卜{I性表達(免疫細胞熒光x一00倍)

一PDLsc、P一POLSc和D一PDLsc自我更新能力比較
【學位授予單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R587.1;R781.4

【引證文獻】

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 倪靈;限制性應激與糖尿病對大鼠牙周炎形成的影響的實驗研究[D];重慶醫(yī)科大學;2012年

本文編號：2655309