【摘要】：目的:大麻素(cannabinoids,CBs)系統(tǒng)作為人體內(nèi)主要的神經(jīng)化學(xué)系統(tǒng),具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng),包括鎮(zhèn)痛、神經(jīng)保護(hù)、免疫和內(nèi)分泌等。N-花生四烯酸氨基乙醇(arachidonyl ethanolamide,AEA)是目前發(fā)現(xiàn)的主要內(nèi)源性大麻素(endogenous cannabinoids,EC)樣物質(zhì)之一,AEA通過與大麻素受體結(jié)合發(fā)揮作用,具有重要的生物學(xué)功能,不僅可以誘導(dǎo)組織的毒性刺激,還可以促進(jìn)炎癥和組織修復(fù)。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)在多種炎癥性疾病的基質(zhì)降解中起著重要作用,主要降解細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)膠原和蛋白等多種成分,目前研究認(rèn)為其分類之一MMP-2是參與牙髓和根尖周病變的重要致病因子。課題組前期已證實(shí)人成牙本質(zhì)細(xì)胞(human odontoblasts,HODs)上大麻素受體1型(cannabinoid type1 receptor,CB1)的功能性表達(dá),因此AEA可能在HODs中發(fā)揮調(diào)控功能。本實(shí)驗(yàn)利用體外建立的HODs樣細(xì)胞模型,首先觀察AEA在HODs樣細(xì)胞中對(duì)MMP-2蛋白表達(dá)發(fā)揮的調(diào)控作用,其次探尋調(diào)控作用發(fā)生的潛在分子機(jī)制,預(yù)測(cè)和驗(yàn)證調(diào)控MMP-2表達(dá)相關(guān)的微小核糖核酸(micro ribonuclenic acid,mi RNA),進(jìn)一步驗(yàn)證mi RNA在AEA調(diào)控HODs樣細(xì)胞MMP-2表達(dá)的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究旨在探討內(nèi)源性大麻素AEA調(diào)控HODs樣細(xì)胞MMP-2表達(dá)相關(guān)的mi RNA,為今后牙髓病和根尖周病臨床治療奠定一些實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:本實(shí)驗(yàn)通過About I等人建立的方法誘導(dǎo)HODs樣細(xì)胞,利用免疫熒光(immunofluorescence,IF)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,q PCR)分析特異性標(biāo)志物牙本質(zhì)涎磷蛋白(Dentin sialophosphoproteins,DSPP)和牙本質(zhì)巢蛋白(nestin)表達(dá)來鑒定培養(yǎng)的HODs樣細(xì)胞。用10mmol/L AEA作用HODs樣細(xì)胞0、12、24、48、72h后通過Western blot(WB)分析MMP-2的蛋白水平隨時(shí)間變化趨勢(shì),再用不同濃度AEA作用HODs樣細(xì)胞一定時(shí)間后通過WB分析MMP-2蛋白水平隨AEA濃度變化趨勢(shì)。為了研究調(diào)控MMP-2表達(dá)的潛在分子機(jī)制,通過靶基因預(yù)測(cè)軟件Target Scan和mi RDB預(yù)測(cè)并篩選出目標(biāo)mi RNA與MMP-2結(jié)合區(qū)域,根據(jù)結(jié)合區(qū)域堿基序列構(gòu)建野生型和突變型增強(qiáng)綠色熒光(enhanced green fluorescent protein,EGFP)MMP-2 3'UTR質(zhì)粒、預(yù)測(cè)的mi RNA過表達(dá)質(zhì)粒和反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO)mi RNA,進(jìn)行EGFP報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證預(yù)測(cè)的mi RNA是否可以直接靶向作用MMP-2 3'UTR。為了進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測(cè)的mi RNA對(duì)MMP-2表達(dá)有調(diào)控作用,在HODs樣細(xì)胞中過表達(dá)或封閉預(yù)測(cè)的mi RNA后通過q PCR和WB檢測(cè)MMP-2的表達(dá)水平,從而確定預(yù)測(cè)的mi RNA可以調(diào)控MMP-2表達(dá)。在上述研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步通過挽救實(shí)驗(yàn)來分析AEA、過表達(dá)預(yù)測(cè)的mi RNA和MMP-2表達(dá)的相關(guān)性,通過q PCR和WB檢測(cè)MMP-2的表達(dá)水平來分析預(yù)測(cè)的mi RNA過表達(dá)后AEA的調(diào)控變化,從而確定調(diào)控發(fā)生的分子機(jī)制。結(jié)果:IF和q PCR結(jié)果顯示培養(yǎng)的細(xì)胞中DSPP和nestin呈陽(yáng)性表達(dá),鑒定為HODs樣細(xì)胞可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。WB結(jié)果顯示10mmol/L AEA作用HODs樣細(xì)胞24h后MMP-2蛋白水平開始明顯上調(diào),72h后達(dá)到與陽(yáng)性對(duì)照(TNF-α)相當(dāng)?shù)乃?證實(shí)MMP-2蛋白水平與AEA作用時(shí)間呈正相關(guān),以72 h作用上調(diào)效果最明顯;不同濃度AEA作用HODs樣細(xì)胞72h后,10mmol/L AEA處理組最先達(dá)到與陽(yáng)性對(duì)照(TNF-α)相當(dāng)?shù)乃?12mmol/L AEA處理組達(dá)到蛋白水平最高峰,證實(shí)隨著AEA濃度的增加MMP-2蛋白水平上調(diào)越明顯。靶基因預(yù)測(cè)軟件Target Scan和mi RDB預(yù)測(cè)并篩選出MMP-2為mi R-136的靶基因,EGFP報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)mi R-136使野生型EGFP-MMP2 3′-UTR質(zhì)粒熒光強(qiáng)度顯著降低,封閉mi R-136使野生型EGFP-MMP2 3′-UTR質(zhì)粒熒光強(qiáng)度增加;然而,過表達(dá)mi R-136或封閉mi R-136對(duì)突變型EGFP-MMP2 3′-UTR質(zhì)粒熒光強(qiáng)度沒有明顯變化,證實(shí)mi R-136能夠直接靶向作用于野生型MMP-2 3′-UTR。q PCR和WB結(jié)果顯示HODs樣細(xì)胞中過表達(dá)mi R-136后MMP-2的m RNA和蛋白水平顯著降低,封閉mi R-136后MMP-2的m RNA和蛋白水平升高,說明mi R-136可對(duì)MMP-2表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。AEA作用HODs樣細(xì)胞不同時(shí)間后,q PCR結(jié)果顯示AEA下調(diào)mi R-136表達(dá)水平;HODs樣細(xì)胞過表達(dá)mi R-136后再進(jìn)行AEA處理,q PCR和WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示單獨(dú)過表達(dá)mi R-136能下調(diào)MMP-2的m RNA和蛋白水平,單純AEA處理能上調(diào)MMP-2的m RNA和蛋白水平,而過表達(dá)mi R-136+AEA處理可以部分上調(diào)MMP-2的m RNA和蛋白水平,證實(shí)AEA可以部分解除HODs樣細(xì)胞中由過表達(dá)mi R-136介導(dǎo)的MMP-2表達(dá)抑制作用。結(jié)論:該研究表明AEA可顯著上調(diào)HODs樣細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)水平;AEA通過mi R-136來調(diào)控HODs樣細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)。
【圖文】：

3)按說明將試劑盒中的 A 液和 B 液按體積 1:1 混合 1min，然后滴到膜上4)放置膠片，曝光時(shí)間為 1～5min，曝光結(jié)束后，立馬放入顯影液內(nèi)，條紋明顯顯示后結(jié)束，過程一般為 1～2min。5)顯影結(jié)束后，將膠片轉(zhuǎn)移到定影液內(nèi)，等膠片透明后結(jié)束，過程通常5～10min，用流水清洗后在常溫下吸干。（8） 凝膠圖象分析：采用掃描儀將膠片上圖像進(jìn)行掃描，并用凝膠圖象處系統(tǒng)分析所需要的條紋。1.2 結(jié)果1.2.1 HODs 樣細(xì)胞的鑒定結(jié)果IF 染色顯示人牙髓組織培養(yǎng)并誘導(dǎo)獲得的細(xì)胞中 DSPP（綠色）和 nest（綠色）呈陽(yáng)性表達(dá)（圖 1A 和 F）。qPCR 結(jié)果顯示細(xì)胞中 DSPP 和 nestin 的 mR表達(dá)水平高（圖 1G），證實(shí)培養(yǎng)獲得的細(xì)胞為 HODs 樣細(xì)胞，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)究。

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文1.2.2 AEA 調(diào)控 HODs 樣細(xì)胞 MMP-2 表達(dá)上調(diào)首先通過 WB 分析 AEA 對(duì) HODs 樣細(xì)胞 MMP-2 表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 10 mol/LAEA 作用 HODs 樣細(xì)胞 24h 后 MMP-2 的蛋白水平明顯上調(diào)，上調(diào)水平與時(shí)間呈正相關(guān)，72h 后上調(diào)到與陽(yáng)性對(duì)照組（GAPDH）相當(dāng)?shù)乃剑▓D 1.2A）。其次檢測(cè)不同濃度 AEA 作用 HODs 樣細(xì)胞 72 小時(shí)后 MMP-2 的蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著 AEA濃度增加，MMP-2 蛋白水平上調(diào)越明顯，，10 mol/LAEA 處理組最先上調(diào)至陽(yáng)性對(duì)照組（GAPDH）相當(dāng)?shù)乃剑?2 mol/LAEA 處理組上調(diào)效果達(dá)到最高峰（圖 1.2B）。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R781

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本文編號(hào)：2654713