發(fā)布時(shí)間：2020-05-07 20:07

【摘要】：IQ結(jié)構(gòu)域三磷酸鳥(niǎo)苷合酶激活蛋白1(IQ-domain GTPase-activating protein 1,IQGAPI)是一種高度保守的細(xì)胞質(zhì)支架蛋白,能與100余種其他蛋白質(zhì)結(jié)合的多功能支架蛋白,是多種信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子。IQGAP1具有兩個(gè)緊密相關(guān)的家族蛋白IQGAP2和IQGAP3,它們具有不同的功能,但是IQGAP1是更廣泛表達(dá)的蛋白質(zhì),IQGAP1涉及骨骼重組和調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附,極性和遷移。IQGAP1還通過(guò)IQ域和通過(guò)富含脯氨酸的WW域?qū)AF和MEK進(jìn)行調(diào)節(jié),以調(diào)節(jié)RAF/MEK/ERK信號(hào)。研究表明IQGAP1是MAPK和Wnt/β-catenin信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)因子。在腫瘤發(fā)生和癌癥進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。IQGAP1在食管鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá),而IQGAP1敲低可以在體外和體內(nèi)降低細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力。同時(shí),過(guò)表達(dá)IQGAP1的癌細(xì)胞中AKT和ERK磷酸化水平上調(diào)。但I(xiàn)QGAP1在舌鱗癌中作用及機(jī)制尚不清楚。本課題進(jìn)行了關(guān)于IQGAP1及ERK在舌鱗癌中的相關(guān)性研究。通過(guò)qPCR檢測(cè)IQGAP1及ERK在舌鱗癌細(xì)胞株CAL27、SCC25、SCC9細(xì)胞中的表達(dá)量,結(jié)果顯示,IQGAP1及ERK均在舌鱗癌細(xì)胞株中高表達(dá)。而當(dāng)沉默IQGAP1后,通過(guò)qPCR及Westerm Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IQGAP1及ERK表達(dá),發(fā)現(xiàn)IQGAP1及ERK在舌鱗癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào);舌鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移均受抑制。第一章IQGAP1基因沉默有效si-RNA的篩選目的:篩選沉默IQGAP1基因的有效si-RNA序列,選擇最優(yōu)序列進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。方法:1.常規(guī)培養(yǎng)舌鱗癌細(xì)胞株CAL27、SCC25、SCC9細(xì)胞;2.qPCR檢測(cè)IQGAP1及ERK在舌鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)量;3.構(gòu)建三個(gè)不同序列si-RNA,沉默IQGAPI基因,分別轉(zhuǎn)染CAL27、SCC25及SCC9,qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默后各組細(xì)胞IQGAP1的表達(dá)量;4.CCK8增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況,根據(jù)各實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選最優(yōu)序列進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:1.IQGAP1在舌鱗癌細(xì)胞株中高表達(dá),同時(shí)ERK在舌鱗癌細(xì)胞株中也表現(xiàn)為高表達(dá);2.三個(gè)不同序列si-RNA沉默IQGAP1后,在CAL27、SCC25、SCC9細(xì)胞株中,IQGAP1均呈現(xiàn)低表達(dá);3.在CCK8增殖實(shí)驗(yàn)中,三組細(xì)胞株中,三個(gè)不同序列si-RNA在不同時(shí)間段有不同程度差異,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中編碼為si-RNA-3746序列在各組細(xì)胞株中均有差異,且其在SCC25中較為明顯且穩(wěn)定,選擇si-RNA-3746及SCC25作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)序列及細(xì)胞株。第二章沉默IQGAP1基因?qū)ι圜[癌細(xì)胞SCC25中ERK基因表達(dá)的影響目的:IQGAPI基因在舌鱗狀細(xì)胞癌中呈現(xiàn)高表達(dá),相應(yīng)ERK基因也高表達(dá)。研究?jī)烧咧g是否存在聯(lián)系,當(dāng)沉默IQGAP1基因,ERK基因表達(dá)是否降低。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)沉默IQGAP1基因后檢測(cè)ERK基因的表達(dá),以驗(yàn)證兩者的相關(guān)性。方法:1.沉默IQGAP1基因,以qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證沉默IQGAP1基因后IQGAP1基因及ERK基因的表達(dá)水平;2.沉默IQGAP1基因,以Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證沉默IQGAP1基因后IQGAP1基因及ERK基因的表達(dá)水平。結(jié)果:1.沉默IQGAP1后,通過(guò)qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,結(jié)果顯示SCC25細(xì)胞中IQGAP1基因表達(dá)量下降,同時(shí)ERK基因表達(dá)量也下降。2.沉默IQGAP1后,通過(guò)Wserern Blot驗(yàn)證,結(jié)果顯示3CC25細(xì)胞中IQGAP1基因蛋白表達(dá)量下降,同時(shí)ERK基因蛋白表達(dá)量也下降。第三章沉默IQGAP1基因?qū)ι圜[癌細(xì)胞SCC25的增殖、侵襲、遷移的影響目的:研究沉默IQGAP1基因后對(duì)舌鱗癌細(xì)胞SCC25的增殖、侵襲、遷移的影響。方法:1.沉默SCC25細(xì)胞IQGAP1基因;2.CCK8檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組的細(xì)胞增殖情況;3.Transwell檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組的細(xì)胞侵襲性的改變;4.Woundhealing檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組的細(xì)胞遷移情況。結(jié)果:沉默SCC25細(xì)胞IQGAP1基因后,SCC25細(xì)胞的增殖性、侵襲性及遷移能力較對(duì)照組顯著下降。全文總結(jié)1.IQGAP1與ERK基因在舌鱗癌細(xì)胞CAL27、SCC25、SCC9中高表達(dá);2.當(dāng)沉默SCC25細(xì)胞中IQGAP1基因時(shí),ERK基因表達(dá)下調(diào),癌細(xì)胞的增殖性、侵襲性、遷移能力下降;3.IQGAP1基因可能是舌鱗癌治療的一個(gè)潛在新靶點(diǎn)。
【圖文】：

（１．ＤＬ２０００；邋２．ＣＡＬ２７；邋３．ＳＣＣ９；邋４．ＳＣＣ２５）逡逑Ｃ２５及ＳＣＣ９邋ＲＮＡ電泳鑒定圖，２８ｓ與１８ｓ條帶２：１，可見(jiàn)ｍＲＮＡｓｍｅａｒ，５ｓ條帶較弱。逡逑ＳＣＣ２５邋ａｎｄ邋ＳＣＣ９邋ＲＮＡ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｙ邋ｖｉｓｉｂｌｅ，邋ｔｈｅ邋ｒａｔｉｏ邋ｉｓ邋ａｂｏｕｔ邋２：１，邋ｖｉｓｉｂｌｅ邋ｍＲＮＡ邋ｓｍｅａｒ，ｐ－ａｃｔｉｎ；邋３．ＳＣＣ９，邋Ｐ－ａｃｔｉｎ；邋４．ＳＣＣ２５，邋ｐ－ａｃｔｉｎ；邋５．ＣＡＬ２７６．ＳＣＣ９，，邋ＩＱＧＡＰ１；邋７．ＳＣＣ２５，邋ＩＱＧＡＰ１）逡逑

逡逑圖１－９沉默ＩＱＧＡＰ１后ＣＡＬ２７ｑＰＣＲ產(chǎn)物電泳圖，卜ａｃｔｉｎ及ＩＱＧＡＰ１，條帶清晰且無(wú)雜逡逑帶，表明沒(méi)有非特異性擴(kuò)增和引物二聚體（ｐ－ａｃｔｉｎ：邋１７４ｂｐ；邋ＩＱＧＡＰ１：邋１７８ｂｐ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－９邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｍａｐ邋ｏｆ邋ＣＡＬ２７邋ｑＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ａｆｔｅｒ邋ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ邋ＩＱＧＡＰ１，邋Ｐ－ａｃｔｉｎ邋ａｎｄ逡逑ＩＱＧＡＰ１，邋ｂａｎｄ邋ｃｌｅａｒ邋ａｎｄ邋ｎｏ邋ｂａｎｄｓ，邋ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ邋ｎｏ邋ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｐｒｉｍｅｒ邋ｄｉｍｅｒ．逡逑（Ｐ－ａｃｔｉｎ：邋１７４邋ｂｐ；邋ＩＱＧＡＰ１：邋１７８邋ｂｐ）逡逑２．４．２原始數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果逡逑表１－３原始數(shù)據(jù)及計(jì)算逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－３邋Ｒａｗ邋ｄａｔａ邋ａｎｄ邋ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ逡逑檢測(cè)項(xiàng)目邐Ｎａｍｅ邐ＣＴ
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R739.86

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本文編號(hào)：2653487