【摘要】：研究背景:由創(chuàng)傷、感染、腫瘤等多種因素引起的口腔頜面部骨組織缺損在臨床上越來越常見,嚴(yán)重影響患者的飲食、美觀和心理健康。傳統(tǒng)療法存在各種各樣的缺點(diǎn):異體骨移植會(huì)引起免疫排斥反應(yīng),自體骨抑制會(huì)造成身體其他部位骨組織的缺失,支架材料未能有理想的生物相容性。因此,發(fā)展一種新型有效的修復(fù)骨組織的方法是十分必要的。轉(zhuǎn)基因療法是目前治療骨缺損的研究熱點(diǎn),但是單純基因不穩(wěn)定且易被降解,因此需要基因載體對基因進(jìn)行保護(hù)。病毒載體轉(zhuǎn)染效率高,但是往往會(huì)引起免疫反應(yīng),生物毒性不容忽視。而非病毒載體特別是納米粒子,粒徑較小,比表面積較大,易被修飾,越來越多地應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因治療中。碳點(diǎn)作為一種新型的納米粒子,成本低廉,制作方便,且多有優(yōu)良的光致發(fā)光的特點(diǎn),可被應(yīng)用于生物傳感、生物成像中,具有成為優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因治療基因載體的性能。因此,研究碳點(diǎn)跨成骨類細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)途徑和胞內(nèi)分布,探索其生物相容性,對碳點(diǎn)作為非病毒基因載體具有重要的意義。研究目的:探討抗壞血酸碳點(diǎn)的生物相容性,明確抗壞血酸碳點(diǎn)進(jìn)入MC3T3細(xì)胞的途徑和在細(xì)胞內(nèi)的分布,為未來抗壞血酸碳點(diǎn)作為非病毒基因載體應(yīng)用于口腔頜面部骨缺損的轉(zhuǎn)基因治療提供理論基礎(chǔ)。研究方法:采用微波法制備抗壞血酸-PEI復(fù)合碳點(diǎn)。采用MTT法檢測碳點(diǎn)對細(xì)胞增殖的影響,Annexin V-PITC/PI雙染法經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測碳點(diǎn)對細(xì)胞凋亡的影響。同時(shí)檢測細(xì)胞周期、細(xì)胞內(nèi)ATP水平、細(xì)胞內(nèi)ROS水平來評估碳點(diǎn)的生物相容性。通過各內(nèi)吞抑制劑的使用,結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)明確MC3T3細(xì)胞攝取碳點(diǎn)的途徑,并通過原子力顯微鏡和透射電鏡的使用加以驗(yàn)證。通過標(biāo)記各細(xì)胞器,結(jié)合碳點(diǎn)本身的綠色熒光明確碳點(diǎn)在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的分布,并通過透射電鏡的使用加以驗(yàn)證。研究結(jié)果:碳點(diǎn)可在藍(lán)色熒光下激發(fā)發(fā)射綠色熒光,進(jìn)入細(xì)胞后主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,能較好地顯示細(xì)胞的輪廓。當(dāng)用40 mg·L-1的碳點(diǎn)處理細(xì)胞24h后,細(xì)胞增殖率尚在80%以上。碳點(diǎn)對細(xì)胞的早期凋亡率影響不大(P0.05)。碳點(diǎn)能降低G0、G1期細(xì)胞的比例(P0.05),上升S期細(xì)胞的比例(P0.05)。碳點(diǎn)能夠上升細(xì)胞的ROS水平,但不明顯(P0.05)。碳點(diǎn)會(huì)降低細(xì)胞的ATP水平(P0.05)。當(dāng)采用氯丙嗪來抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞飲作用時(shí),碳點(diǎn)的細(xì)胞攝取率降低;當(dāng)采用諾考達(dá)唑或4℃孵育來抑制能量依賴性的內(nèi)吞途徑時(shí),碳點(diǎn)的細(xì)胞攝取率下降明顯(P0.05),但尚有碳點(diǎn)能夠被細(xì)胞攝取。將碳點(diǎn)與細(xì)胞共孵育15min后,與空白對照組相比,細(xì)胞表面的起伏變大,并且產(chǎn)生許多直徑在100nm左右的凹陷,但當(dāng)碳點(diǎn)與細(xì)胞共孵育3h后,細(xì)胞膜表面趨于平緩,且細(xì)胞膜表面的凹陷減少。透射電鏡的結(jié)果表明,碳點(diǎn)進(jìn)入細(xì)胞的時(shí)候伴隨著細(xì)胞膜的內(nèi)陷。碳點(diǎn)的綠色熒光與標(biāo)記溶酶體、線粒體的紅色熒光重疊得較好,但與標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的紅色熒光只有部分重疊,而標(biāo)記高爾基體的紅色熒光則不是很明顯。透射電鏡的結(jié)果表示,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和溶酶體上都可以發(fā)現(xiàn)碳點(diǎn)的影像,未見明顯的高爾基體。此外,在細(xì)胞核內(nèi)也可以發(fā)現(xiàn)碳點(diǎn)的影像。研究結(jié)論:1.碳點(diǎn)具有激發(fā)依賴性,能夠在藍(lán)色熒光的激發(fā)下發(fā)射綠色熒光,也能夠在綠色熒光的激發(fā)下發(fā)射紅色熒光,但主要發(fā)射綠色熒光。碳點(diǎn)具有良好的顯微細(xì)胞成像能力,能夠進(jìn)入細(xì)胞,主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,能較好地顯示細(xì)胞的輪廓。碳點(diǎn)的細(xì)胞毒性較低,生物相容性較好。2.碳點(diǎn)可以通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞飲作用內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞,也能通過非能量依賴性的途徑進(jìn)入細(xì)胞,碳點(diǎn)進(jìn)入細(xì)胞前可發(fā)生聚集,可伴隨相應(yīng)區(qū)域細(xì)胞膜的內(nèi)陷。3.碳點(diǎn)內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞后主要分布在細(xì)胞的內(nèi)膜系統(tǒng)上,在溶酶體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上都有分布,可包裹在囊泡內(nèi)在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行運(yùn)輸。此外,碳點(diǎn)還能進(jìn)入細(xì)胞核。
【圖文】：

CDs在藍(lán)色熒光激發(fā)下發(fā)射綠色熒光，，被細(xì)胞攝取后顯示出細(xì)胞的輪廓（200

MTT實(shí)驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R782.4

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本文編號(hào)：2652994