【摘要】：研究背景:由創(chuàng)傷、感染、腫瘤等多種因素引起的口腔頜面部骨組織缺損在臨床上越來越常見,嚴重影響患者的飲食、美觀和心理健康。傳統(tǒng)療法存在各種各樣的缺點:異體骨移植會引起免疫排斥反應,自體骨抑制會造成身體其他部位骨組織的缺失,支架材料未能有理想的生物相容性。因此,發(fā)展一種新型有效的修復骨組織的方法是十分必要的。轉(zhuǎn)基因療法是目前治療骨缺損的研究熱點,但是單純基因不穩(wěn)定且易被降解,因此需要基因載體對基因進行保護。病毒載體轉(zhuǎn)染效率高,但是往往會引起免疫反應,生物毒性不容忽視。而非病毒載體特別是納米粒子,粒徑較小,比表面積較大,易被修飾,越來越多地應用于轉(zhuǎn)基因治療中。碳點作為一種新型的納米粒子,成本低廉,制作方便,且多有優(yōu)良的光致發(fā)光的特點,可被應用于生物傳感、生物成像中,具有成為優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因治療基因載體的性能。因此,研究碳點跨成骨類細胞膜轉(zhuǎn)運途徑和胞內(nèi)分布,探索其生物相容性,對碳點作為非病毒基因載體具有重要的意義。研究目的:探討抗壞血酸碳點的生物相容性,明確抗壞血酸碳點進入MC3T3細胞的途徑和在細胞內(nèi)的分布,為未來抗壞血酸碳點作為非病毒基因載體應用于口腔頜面部骨缺損的轉(zhuǎn)基因治療提供理論基礎(chǔ)。研究方法:采用微波法制備抗壞血酸-PEI復合碳點。采用MTT法檢測碳點對細胞增殖的影響,Annexin V-PITC/PI雙染法經(jīng)流式細胞儀檢測碳點對細胞凋亡的影響。同時檢測細胞周期、細胞內(nèi)ATP水平、細胞內(nèi)ROS水平來評估碳點的生物相容性。通過各內(nèi)吞抑制劑的使用,結(jié)合流式細胞術(shù)明確MC3T3細胞攝取碳點的途徑,并通過原子力顯微鏡和透射電鏡的使用加以驗證。通過標記各細胞器,結(jié)合碳點本身的綠色熒光明確碳點在亞細胞結(jié)構(gòu)上的分布,并通過透射電鏡的使用加以驗證。研究結(jié)果:碳點可在藍色熒光下激發(fā)發(fā)射綠色熒光,進入細胞后主要分布在細胞質(zhì)中,能較好地顯示細胞的輪廓。當用40 mg·L-1的碳點處理細胞24h后,細胞增殖率尚在80%以上。碳點對細胞的早期凋亡率影響不大(P0.05)。碳點能降低G0、G1期細胞的比例(P0.05),上升S期細胞的比例(P0.05)。碳點能夠上升細胞的ROS水平,但不明顯(P0.05)。碳點會降低細胞的ATP水平(P0.05)。當采用氯丙嗪來抑制網(wǎng)格蛋白介導的胞飲作用時,碳點的細胞攝取率降低;當采用諾考達唑或4℃孵育來抑制能量依賴性的內(nèi)吞途徑時,碳點的細胞攝取率下降明顯(P0.05),但尚有碳點能夠被細胞攝取。將碳點與細胞共孵育15min后,與空白對照組相比,細胞表面的起伏變大,并且產(chǎn)生許多直徑在100nm左右的凹陷,但當碳點與細胞共孵育3h后,細胞膜表面趨于平緩,且細胞膜表面的凹陷減少。透射電鏡的結(jié)果表明,碳點進入細胞的時候伴隨著細胞膜的內(nèi)陷。碳點的綠色熒光與標記溶酶體、線粒體的紅色熒光重疊得較好,但與標記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的紅色熒光只有部分重疊,而標記高爾基體的紅色熒光則不是很明顯。透射電鏡的結(jié)果表示,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和溶酶體上都可以發(fā)現(xiàn)碳點的影像,未見明顯的高爾基體。此外,在細胞核內(nèi)也可以發(fā)現(xiàn)碳點的影像。研究結(jié)論:1.碳點具有激發(fā)依賴性,能夠在藍色熒光的激發(fā)下發(fā)射綠色熒光,也能夠在綠色熒光的激發(fā)下發(fā)射紅色熒光,但主要發(fā)射綠色熒光。碳點具有良好的顯微細胞成像能力,能夠進入細胞,主要分布在細胞質(zhì)中,能較好地顯示細胞的輪廓。碳點的細胞毒性較低,生物相容性較好。2.碳點可以通過網(wǎng)格蛋白介導的胞飲作用內(nèi)吞進入細胞,也能通過非能量依賴性的途徑進入細胞,碳點進入細胞前可發(fā)生聚集,可伴隨相應區(qū)域細胞膜的內(nèi)陷。3.碳點內(nèi)吞進入細胞后主要分布在細胞的內(nèi)膜系統(tǒng)上,在溶酶體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上都有分布,可包裹在囊泡內(nèi)在細胞內(nèi)進行運輸。此外,碳點還能進入細胞核。
【圖文】：

CDs在藍色熒光激發(fā)下發(fā)射綠色熒光，，被細胞攝取后顯示出細胞的輪廓（200

MTT實驗
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R782.4

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本文編號：2652994