【摘要】：[目的]研究牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis, P.g)上清液對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)增殖及其炎性因子IL-1β及IL-6表達的影響,為探討牙周炎與動脈粥樣硬化(atherosclerosis, As)的關系及其機制提供實驗依據(jù)。 [方法]采用酶消化法法進行HUVECs原代培養(yǎng),并進行細胞來源鑒定；厭氧條件下培養(yǎng)并獲得牙齦卟啉單胞菌P.g；用MTT法檢測不同濃度的P.g上清液對HUVECs增殖的影響,根據(jù)MTT結(jié)果選擇濃度為0.5×107CFU/ml的P.g上清液刺激HUVECs,透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)的改變,并分別在培養(yǎng)后6h、12h、18h、24h時采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定培養(yǎng)液上清中IL-1β及IL-6的水平;同時分別在培養(yǎng)后6h、12h、18h、24h通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測IL-1β、IL-6基因的表達變化。應用SPSS11.0軟件包采用直線回歸和方差分析對結(jié)果進行分析。 [結(jié)果](1)本實驗研究條件下所獲得的HUVECs,呈單層“鋪路石”樣排列,免疫組化法可見內(nèi)皮細胞胞漿中人第Ⅷ因子相關抗原呈陽性反應。 (2)與空白對照組相比較,高濃度的細菌上清液(4.0×107CFU/ml,2.0×107CFU/ml,1.0×107CFU/ml,)可明顯抑制HUVECs增殖(P0.05),而在相對低濃度時(0.5×107CFU/ml,0.25×107CFU/ml,1.25×106CFU/ml,6.25×105CFU/ml)則對HUVECs增殖無明顯抑制作用(P0.05)。 (3)用0.5×107CFU/ml的細菌上清液刺激HUVECs 24h后,透射電鏡下細胞超微結(jié)構(gòu)在形態(tài)上與空白對照組相比有輕微的損傷性改變,部分細胞可見擴張的線粒體,且伴有線粒體嵴溶解,部分細胞內(nèi)可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多。 (4) ELISA實驗結(jié)果顯示,HUVECs在無P.g上清液刺激的情況下也可表達低水平的IL-1β和IL-6,在濃度為0.5×107上清液的刺激下,HUVECs的IL-1β水平在18h、24h時顯著增高,并且明顯高于對照組(P0.05)；HUVECs的IL-6水平在12h、18h顯著增高(P0.05),并且在12h、18h、24h三個時段明顯高于對照組(P0.05),而對照組間不同時間段其表達量無顯著性差異(P0.05)。 (5)RT-PCR實驗結(jié)果顯示,在濃度為0.5×107的P.g上清液刺激下,HUVECs在6h、12h、18h、24h后細胞內(nèi)均有IL-1p、IL-6的基因的表達,IL-1β在12h、18h的表達明顯高于對照組(P0.05),IL-6在12h的表達明顯高于對照組(P0.05),而對照組間不同時間段其表達無顯著性差異(P0.05)。 [結(jié)論]高濃度的P.g上清液可明顯抑制HUVECs的增殖,在濃度為0.5×107的P.g上清液刺激下,HUVECs的超微結(jié)構(gòu)有輕微的損傷性改變,并且可促進致炎因子IL-1β和IL-6的蛋白及基因表達,提示P.g感染可能促進內(nèi)皮細胞分泌炎癥因子增加,導致內(nèi)皮細胞功能紊亂,從而可能在As的發(fā)生發(fā)展中起一定作用。
【圖文】：

5.1P.g上清液對HUvECs分泌IL一lp的影響，見表2及圖14。結(jié)果顯示，HUvECs在無Rg上清液刺激的情況下也可少量表達IL一lp，在濃度為0.5、107上清液的刺激下，HUvEcs的IL-lp水平在18h、24h顯著增高，并且明顯高于對照組(P<0.05)，而對照組間不同時間段分泌水平無顯著性差異(P>0.05)。表2P.g上清對HUvECs生成ILlp的影響(濃度p留ml，x士s，n=6)6h1Zh1sh24h實驗組對照組30.72士0.9730.41士0.70.58士1..95士0..55士1.70*△.12士0.4634.3008士1.45*△.99士0.34口、J，1.，J，J460O夕.、曰2nU，j內(nèi)」注:*表示與對照組比較，△表示與6h組比較，P<0.05P<0.05

5.2P.g上清液對HIJvECs分泌IL一6的影響，見表3、圖15。結(jié)果顯示，HUVECs在無P.g上清液刺激的情況下也可少量表達IL一6，在濃度為0.5xl07上清液的刺激下，HUvEcs的IL一6水平在12h、18h顯著增高，在24h時段水平有所降低，但依然明顯高于對照組(P<0.05)，而對照組間不同時間段其分泌水平無顯著性差異(P>0.05)。表 3P.g上清對HIJVECs生成IL·6的影響(濃度pg/ml，x士s，n=6)12h18h24h實驗組對照組277.87士14.31261，34士 15.13304.54士21.47*△269.34士20，45 315.21士10.93*△271.47士9.69277.34士4.15*263.26士 11.44注:*表示與對照組比較，，△表示與6h組比較，P<0.05P<0.05
【學位授予單位】：昆明醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R781.4

【參考文獻】

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1 魏東;;牙周病患者治療前后血清IL-2、IL-6和TNF-α水平及其臨床意義[J];放射免疫學雜志;2005年06期

2 張明珠;梁景平;;口腔致病菌與動脈粥樣硬化的研究進展[J];國際口腔醫(yī)學雜志;2008年01期

3 秦明春;王若光;秦莉花;劉小麗;李春梅;劉惠萍;葉贊;;人臍靜脈內(nèi)皮細胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定[J];湖南中醫(yī)藥大學學報;2007年04期

4 吳娟;孫衛(wèi)斌;季勇;林良緣;;牙齦卟啉單胞菌促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞一氧化氮的生成[J];南京醫(yī)科大學學報(自然科學版);2009年02期

本文編號：2651387