【摘要】：在正畸治療程中,牙根的吸收與修復(fù)往往伴隨左右,當(dāng)二者失衡時,則可能出現(xiàn)“正畸導(dǎo)致的炎性牙根吸收(Orthodontically induced inflammatory rootresorption,OIIRR)”。OIIRR具有高發(fā)性及難預(yù)測性的特點(diǎn),但其發(fā)生機(jī)制及預(yù)防手段尚未明了。牙骨質(zhì)的表面存在著大量成牙骨質(zhì)細(xì)胞,其主要功能在于表達(dá)與礦化相關(guān)的蛋白,如骨鈣素(Osteocalcin,OCN)、骨涎蛋白(Bone sialoprotein,BSP)等,分泌基質(zhì)形成鈣化結(jié)節(jié)和牙骨質(zhì)。有文獻(xiàn)報(bào)道在正畸治療時,無論是牙根發(fā)生吸收抑或修復(fù),成牙骨質(zhì)細(xì)胞都處在激活的狀態(tài),這提示在受力時,成牙骨質(zhì)細(xì)胞在牙骨質(zhì)的破壞以及再生中都發(fā)揮著不可忽視的作用。近年來有文獻(xiàn)報(bào)道,正畸作用力下牙周環(huán)境氧分壓的下降導(dǎo)致成牙骨質(zhì)細(xì)胞凋亡增加也可能是牙根發(fā)生吸收破壞的機(jī)制。有實(shí)驗(yàn)已證明,短暫的缺氧使成牙骨質(zhì)細(xì)胞增殖活性下降,同時凋亡增加;雖伴有一過性礦化功能增強(qiáng),但長時間缺氧后其礦化功能仍表現(xiàn)為降低。L-精氨酸(L-Arginine,L-arg)作為一氧化氮供體,有文獻(xiàn)報(bào)道其可以增加組織和細(xì)胞的缺氧耐受性,抑制細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)包括成骨細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的增殖及其功能活性。據(jù)此,在正畸治療時牙周缺氧環(huán)境中,L-arg是否對成牙骨質(zhì)細(xì)胞有同樣的影響,從而減少正畸導(dǎo)致的牙根吸收,目前未見相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谀M正畸加力過程中牙周的局部缺氧環(huán)境,研究在低氧環(huán)境中L-arg對成牙骨質(zhì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響,并通過大鼠正畸牙移動模型的構(gòu)建,在體內(nèi)研究L-arg對牙齒加力過程中發(fā)生的牙根吸收的影響,以期為牙根吸收機(jī)制研究新方向提供證據(jù),進(jìn)一步指導(dǎo)臨床治療。本實(shí)驗(yàn)分為體外及體內(nèi)兩個部分:實(shí)驗(yàn)一:體外低氧環(huán)境下L-arg對成牙骨質(zhì)細(xì)胞OCCM-30增殖及凋亡的影響。方法:在低氧環(huán)境中(2%O_2,5%CO_2,93%N_2)用含有不同濃度L-arg的培養(yǎng)基(0μmol/l,30μmol/l,60μmol/l,120μmol/l,240μmol/l,360μmol/l)培養(yǎng)OCCM-30,分別于24小時和48小時用CCK-8比色法檢測細(xì)胞增殖情況,使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡水平。在低氧環(huán)境中選用含有L-arg濃度分別為0μmol/l和120μmol/l的培養(yǎng)基培養(yǎng)OCCM-30,48小時后,采用實(shí)時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測Caspase-3、Caspase-9、Bax以及Bcl-2的基因表達(dá),運(yùn)用蛋白免疫印跡法(Western-blot)檢測Caspase-3、Caspase-9、Bax以及Bcl-2的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:低氧環(huán)境下L-arg作用24小時后,CCK-8檢測顯示:L-arg濃度為0μmol/l時,OCCM-30細(xì)胞活力相比常氧環(huán)境的對照組明顯下降,差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。當(dāng)L-arg的濃度為30μmol/l時,OCCM-30細(xì)胞的活力較0μmol/l時明顯增加,差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),直至濃度為120μmol/l,細(xì)胞活力呈現(xiàn)上升達(dá)峰值,隨后濃度增加,活力反而降低。流式細(xì)胞儀檢測顯示:L-arg濃度為0μmol/l時OCCM-30細(xì)胞凋亡率相比常氧環(huán)境中的對照組大幅上升,差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),當(dāng)L-arg的濃度為30μmol/l,細(xì)胞凋亡率較0μmol/l時下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),直至濃度為120μmol/l,細(xì)胞凋亡率下降至最低,隨后濃度增加,細(xì)胞凋亡又增加。在48小時cck-8及流式細(xì)胞儀檢測得到的趨勢和24小時類似。低氧環(huán)境下培養(yǎng)48小時后,RT-PCR檢測結(jié)果顯示:未加入L-arg時,OCCM-30細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9、Bax因子的基因表達(dá)較常氧對照組均增加,L-arg濃度為120μmol/l時,表達(dá)較未加入時明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);未加入L-arg時Bcl-2基因表達(dá)較常氧對照組減少,L-arg濃度為120μmol/l時,表達(dá)較未加入L-arg時明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。低氧環(huán)境下培養(yǎng)48小時后,Western-blot檢測顯示:未加入L-arg時,OCCM-30細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9、Bax因子的蛋白表達(dá)較常氧對照組增加,L-arg濃度為120μmol/l時,表達(dá)較未加入L-arg時下降;Bcl-2蛋白表達(dá)與上訴因子呈相反趨勢。結(jié)論:低氧刺激會抑制OCCM-30增殖促進(jìn)OCCM-30凋亡,L-arg可有效促進(jìn)低氧環(huán)境中OCCM-30的增殖抑制低氧環(huán)境中OCCM-30的凋亡,且濃度為120μmol/l增殖水平達(dá)到峰值且凋亡水平降到最低。其機(jī)制可能與抑制了Caspase-3、Caspase-9、Bax基因和蛋白的表達(dá)并促進(jìn)了Bcl-2基因和蛋白的表達(dá)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)二:體內(nèi)局部應(yīng)用L-arg對大鼠正畸牙移動中牙根吸收的影響。目的:探究應(yīng)用L-arg對在大鼠正畸牙移動中發(fā)生的牙根吸收的影響。方法:隨機(jī)將36只8周齡健康的雄性SD大鼠平均分成3組,空白組、對照組(PBS組)、實(shí)驗(yàn)組(L-arg組)分別12只,在各組大鼠的左側(cè)上頜的第一磨牙牙冠上施加大小為50 g方向?yàn)榻械牧?隔天在左側(cè)上頜第一磨牙的頰側(cè)黏骨膜下注射每組對應(yīng)的藥物,對照組為PBS,對照組為L-arg,空白組只加力不注射任何藥物。于第7、14?天處死大鼠,游離上頜骨,制備包含第一磨牙的牙槽骨標(biāo)本,進(jìn)行Micro-Computed Tomography(Micro-CT)掃描,數(shù)據(jù)導(dǎo)入Mimics19.0軟件采用三維凸包法計(jì)算牙根根上1/3及根中1/3部分的吸收陷窩體積,并將標(biāo)本包埋、切片后抗酒石酸酸性磷酸酶的染色(TRAP染色)、PCNA免疫組化染色以及TUNEL染色觀察牙周組織中破骨細(xì)胞數(shù)目和牙周細(xì)胞的增殖凋亡情況。結(jié)果:加力7和14天后,三維凸包法計(jì)算結(jié)果顯示:對照組和空白組吸收陷窩體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,實(shí)驗(yàn)組的吸收陷窩體積較相對照組組均減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);TRAP染色結(jié)果顯示:對照組和空白組的破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,實(shí)驗(yàn)組相對于對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;PCNA染色和TUNEL染色顯示:實(shí)驗(yàn)組大鼠第一磨牙近中根的牙周組織壓力側(cè)近牙根的細(xì)胞中處于增殖狀態(tài)的較對照組增加,而牙周組織凋亡的細(xì)胞百分率降低。結(jié)論:局部應(yīng)用一定濃度的L-arg可以減少大鼠正畸牙移動過程中的牙根吸收。
【圖文】：

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用 SPSS20.0 軟件對各組結(jié)果進(jìn)行單因素的方差分析，P＜0.05 認(rèn)為均數(shù)間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。2 結(jié)果2.1 CCK-8 檢測低氧環(huán)境下 L-arg 對 OCCM-30 增殖水平的影響低氧環(huán)境下 L-arg 作用 24 小時以及 48 小時后，CCK-8 檢測顯示：L-arg 濃度為 0μ mol/ l 時，OCCM-30 細(xì)胞活力相比常氧環(huán)境的對照組明顯下降，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0.05)。當(dāng) L-arg 的濃度為 30μ mol/ l 時，，OCCM-30 細(xì)胞的活力較0μ mol/ l 時明顯增加，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0.05)，直至濃度為 120μ mol/l，細(xì)胞活力呈現(xiàn)上升達(dá)峰值，隨后濃度增加，活力反而降低(如圖 1 示)。

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文Figure 1. Effects of different concentrations of l-arg on the proliferation of OCCM-30 oxia （compared with control group, *P<0.05；compared with 0μmol/l group #P<02 流式細(xì)胞儀檢測低氧下 L-arg 對 OCCM-30 凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測顯示：L-arg 濃度為 0μ mol/ l 時 OCCM-30 細(xì)胞凋亡率相環(huán)境中的對照組大幅上升，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0.05)，當(dāng) L-arg 的 30μ mol/ l，細(xì)胞凋亡率較 0μ mol/ l 時下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0.至濃度為 120μ mol/l，細(xì)胞凋亡率下降至最低，隨后濃度增加，細(xì)胞凋亡。在 48 小時 cck-8 及流式細(xì)胞儀檢測得到的趨勢和 24 小時類似（如圖 2 示
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R783.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 蔡珍珍;徐廣有;溫秋婷;王紹清;張曉杰;張靜艷;;柴胡皂苷對抑郁模型大鼠行為及海馬Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)的影響[J];北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2015年02期

2 郭妍芳;陳巖;;Micro-CT及其在口腔正畸學(xué)中的應(yīng)用[J];疾病監(jiān)測與控制;2014年05期

本文編號：2649356