發(fā)布時(shí)間：2020-05-05 01:04

【摘要】：涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma, SACC）是唾液腺最常見的惡性腫瘤之一，具有嗜神經(jīng)侵襲（perineural invasion, PNI）的特性。由于SACC極易沿神經(jīng)浸潤性生長和轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除范圍不易掌握，常導(dǎo)致患者預(yù)后較差。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（extracellularmatrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN）在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，通過調(diào)節(jié)多種基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）的表達(dá)從而促進(jìn)惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。然而，EMMPRIN在SACC嗜神經(jīng)侵襲中的作用及機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。 研究目的： 1.利用免疫組化、免疫熒光，western blot方法分析EMMPRIN在SACC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)及與SACC嗜神經(jīng)侵襲的關(guān)系。 2.利用蛋白拮抗和RNAi技術(shù)分析EMMPRIN在SACC細(xì)胞嗜神經(jīng)侵襲中的作用及可能機(jī)制。 研究方法： 1.采用免疫組化Envision~(TM)法檢測35例嗜神經(jīng)侵襲和37例無神經(jīng)侵襲SACC組織中EMMPRIN、MMP-2、MMP-9的表達(dá)情況，分析EMMPRIN的表達(dá)與嗜神經(jīng)侵襲、MMP-2及MMP-9表達(dá)之間的關(guān)系；采用細(xì)胞免疫組化、免疫熒光，，western blot方法檢測EMMPRRIN在SACC-LM和SACC-83細(xì)胞系的表達(dá)情況；通過抗體拮抗實(shí)驗(yàn)分析拮抗EMMPRIN的表達(dá)對(duì)SACC-LM細(xì)胞體外粘附、明膠酶分泌和侵襲能力的影響。 2.通過RNAi技術(shù)和EMMPRIN siRNA慢病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定沉默EMMPRIN表達(dá)的SACC-83細(xì)胞株。 3.利用黏附實(shí)驗(yàn)、明膠酶譜實(shí)驗(yàn)分析沉默EMMPRIN對(duì)SACC-83細(xì)胞黏附和MMPs分泌能力的影響；利用MTT、荷瘤實(shí)驗(yàn)、體外嗜神經(jīng)侵襲模型、體內(nèi)嗜裸鼠坐骨神經(jīng)侵襲模型分析沉默EMMPRIN對(duì)SACC-83細(xì)胞增殖和嗜神經(jīng)侵襲的影響。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1. EMMPRIN在SACC組織和細(xì)胞系高表達(dá)，EMMPRIN、MMP-2和MMP-9在SACC嗜神經(jīng)侵襲組的表達(dá)明顯高于無神經(jīng)侵襲組，EMMPRIN與SACC的嗜神經(jīng)侵襲現(xiàn)象及MMP-2、MMP-9的表達(dá)顯著相關(guān)，拮抗EMMPRIN在SACC-LM細(xì)胞系的表達(dá)可顯著抑制SACC-LM細(xì)胞黏附ECM的能力、MMP-2和MMP-9的表達(dá)及體外侵襲能力。 2.成功構(gòu)建了EMMPRIN siRNA慢病毒真核表達(dá)載體系統(tǒng)。結(jié)合有限稀釋法及G418壓力篩選，構(gòu)建了EMMPRIN siRNA慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，證實(shí)在篩選獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，EMMPRIN在mRNA和蛋白水平均可被顯著抑制。 3.沉默EMMPRIN基因可顯著抑制SACC-83細(xì)胞體外增殖、對(duì)ECM和神經(jīng)細(xì)胞的黏附、MMP-2和MMP-9的分泌及體外嗜神經(jīng)侵襲性能力。裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)顯示沉默EMMPRIN基因可顯著抑制SACC-83細(xì)胞的體內(nèi)成瘤體積及細(xì)胞增殖指數(shù)。體內(nèi)嗜裸鼠坐骨神經(jīng)侵襲模型顯示沉默EMMPRIN基因可顯著抑制SACC-83細(xì)胞的體內(nèi)嗜神經(jīng)侵襲，減輕坐骨神經(jīng)功能障礙和腫脹程度，同時(shí)抑制腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞MMP-2和MMP-9的表達(dá)。 結(jié)論： 1. EMMPRIN在SACC組織和細(xì)胞系高表達(dá)，與SACC的嗜神經(jīng)侵襲現(xiàn)象顯著相關(guān)。 2. EMMPRIN在SACC嗜神經(jīng)侵襲過程中發(fā)揮重要作用，其促SACC嗜神經(jīng)侵襲的機(jī)制是：（1）誘導(dǎo)SACC細(xì)胞對(duì)ECM和神經(jīng)細(xì)胞的黏附；（2）誘導(dǎo)SACC及基質(zhì)細(xì)胞MMP-2和MMP-9的表達(dá)和活性。 3.通過RNAi技術(shù)沉默EMMPRIN的表達(dá)可有效抑制SACC細(xì)胞體外、體內(nèi)增殖和嗜神經(jīng)侵襲，為SACC嗜神經(jīng)侵襲的基因治療提供了新的參考靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R739.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2649268