【摘要】： 成牙本質細胞分化和牙本質形成的機制至今尚未完全明確。隨著對牙髓牙本質復合體研究的逐步深入，對成牙本質細胞的需求已極為廣泛，，但由于天然成牙本質細胞數量有限，獲取足夠量的純化的成牙本質細胞尚難以實現。因此，建立穩(wěn)定的、克隆化的、具有成牙本質細胞生物學表型和功能的細胞系已成為急需。然而，人牙乳頭組織來源的牙乳頭外胚間充質細胞和(或)成牙本質細胞在通常的體外培養(yǎng)條件下經過十余次的傳代后，就會停止分裂增殖，發(fā)生衰老和死亡。有學者在培養(yǎng)原代成牙本質細胞和／或牙乳頭細胞的基礎上，誘導其自發(fā)性永生化或轉染永生化基因(如sV40大T抗原和HPV18 E6／E7等DNA腫瘤病毒)，建立了永生化的小鼠成牙本質細胞系和牛成牙本質細胞樣細胞系，如MDPC-23、M06-G3，但僅具有成牙本質細胞的部分特征。同時，它們是腫瘤病毒誘導的永生化細胞系，有許多局限性：外源性基因的整合是隨機的，其表達產物可干擾細胞內生理途徑而發(fā)生非預期的改變；轉染獲得的是轉化細胞而非正常細胞，其表型、核型等可發(fā)生改變；并非所有的細胞系都是“無限增殖”，有的僅渡過了衰老期(senescence，M1期)而延長了細胞壽命。 為了克服現有細胞系的缺點，本研究將人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因轉染至原代人成牙本質細胞樣細胞，激活端粒酶，細胞逾越M1期和危機期(crisis，M2期)而發(fā)生永生化，成功建立起永生化細胞系。由于hTERT激活端粒酶誘導細胞永生化的過程類似胚胎干細胞內存在的生理途徑，故該永生化細胞系保留了更多的人成牙本質細胞的生物學特征和功能學特征。主要進行了如下幾方面的研究： 一、人成牙本質細胞樣細胞的原代培養(yǎng) 取8月齡合法引產胎兒，剝離乳磨牙胚牙乳頭，組織塊法培養(yǎng)。原代細胞作平板克隆，礦化液培養(yǎng)10天后，濾紙片法挑取了3個與成牙本質細 第四軍醫(yī)大學博士學位論文 胞形態(tài)相似的細胞克隆，擴大培養(yǎng)。其中克隆a來源的細胞呈梭形、未見 核極化，部分具有單側較長細胞突起。同時它們在InRNA的水平上表達牙本 質基質蛋白 1（denim matrix protein，DMPI）和牙本質涎磷蛋白 （dent。n slalonhosnhonrotein，DSPP），具有較高堿性磷酸酶 （alkaline PhosPhatase，ALP）活性，在礦化液誘導下形成細胞結節(jié)并礦 化。因此，該培養(yǎng)細胞為人成牙本質細胞樣細胞，為下一步的研究奠定了 基礎。 二、永生化人成牙本質細胞樣細胞系的建立 采用脂質體轉染法，將編碼 hTERT 和 neo 基因的真核表達質粒 pCIneo－h(huán)TERT導入原代培養(yǎng)的人成牙本質細胞樣細胞。培養(yǎng)液加 G4lS篩 選約一個月后，抗性細胞克隆形成，濾紙片法轉移、擴增，共獲得5個細 胞克隆。hTERT穩(wěn)定轉染入細胞，表達mRNA及其蛋白質，同時細胞端粒酶 活性轉為陽性。克隆sb來源的細胞在體外長期連續(xù)培養(yǎng)下生長良好，至今 傳代達56代，約6個月，命名為hTERT介導的永生化人成牙本質細胞樣細 胞系（hTERT－immortalized odontoblast－like cell line，hTERT－h(huán)od－ 工）。 三、永生化人成牙本質細胞樣細胞系的生物學特征 體外連續(xù)培養(yǎng)過程中，hTERT－h(huán)odl 呈現成纖維細胞樣形態(tài)，細胞器 發(fā)達，生長增殖活躍，具有克隆形成能力。同時，細胞核型正常，無裸鼠 致瘤性，在軟瓊脂內不能生長，血清依賴性無顯著降低，仍具有接觸抑制 性�？傊琱TERT－h(huán)od－1基本上為正常細胞而無明顯轉化特征，保持了人 成牙本質細胞樣細胞的生物學特征。 四、永生化人成牙本質細胞樣細胞系的功能學特征 hTEBT－h(huán)od－1 在 mRNA水平上表達骨涎蛋白（bone sialoproteln， BSP）、DMPI 和 DSPP，在蛋白質水平上表達 1 型膠原和牙本質涎蛋白 （denim sialoprotein，DSP）。在礦化液誘導下，細胞 ALP活性升高， 骨鈣素（osteocalcin，OC）分泌量增加，細胞復層生長而形成細胞結節(jié)， －4． 第四軍醫(yī)大學博士學位論文 分泌基質并礦化。透射電子顯微鏡觀察顯示：細胞蛋白質合成分泌功能活 躍，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）見大量網狀或平行排列的 膠原（原）纖維和高電子密度的針狀晶體沉積。細胞內和ECM中可見基質 膜泡。因此，hTERT－h(huán)odl在體外培養(yǎng)中可以分泌牙本質細胞外基質并礦 化。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2002
【分類號】：R780.2

【引證文獻】

相關期刊論文 前2條

1 何文喜,牛忠英,趙守亮,臧曉霞,高杰;成牙本質細胞系MDPC-23的生物學特性[J];口腔醫(yī)學研究;2004年02期

2 王捍國,肖明振,趙守亮,郝建軍,郝玉慶;永生化人成牙本質細胞樣細胞系體外礦化的初步觀察[J];牙體牙髓牙周病學雜志;2004年11期

本文編號：2648327