【摘要】：目的:通過(guò)牙齦卟啉單胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharides,P.g LPS)及與一定頻率大小的單軸循環(huán)拉伸應(yīng)變(2500u,0.5Hz)協(xié)同作用于體外培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細(xì)胞(Human periodontal ligment fibroblasts,h PDLFs),觀察分析經(jīng)典Wnt通路分子β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、非經(jīng)典Wnt通路分子Wnt5a、受體酪氨酸激酶樣的孤獨(dú)受體2(Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2,Ror2)和促進(jìn)骨形成的關(guān)鍵調(diào)控因子核心結(jié)合蛋白因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)m RNA和蛋白的變化情況,初步探討Wnt通路在炎癥與力協(xié)同作用時(shí)骨吸收機(jī)制中可能起的作用,為進(jìn)一步探究咬合創(chuàng)傷加重牙周炎時(shí)牙周組織破壞提供理論依據(jù)。方法:1.經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(TMUh MEC2018104),選擇就診于天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院頜面外科因正畸要求拔除的12-16歲健康雙尖牙,酶消化法培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞,免疫組化方法鑒定細(xì)胞來(lái)源。2.RT-PCR法檢測(cè)力學(xué)微環(huán)境下h PDLFs和炎性h PDLFs中β-catenin、Runx2、Wnt5a和Ror2 m RNA隨時(shí)間推移的表達(dá)變化情況,觀察目的分子m RNA表達(dá)峰值或谷值出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn),即最佳加力時(shí)長(zhǎng);用RT-PCR法和Western blot法檢測(cè)在該加力時(shí)長(zhǎng)時(shí)P.g LPS組(P組)、單軸循環(huán)拉伸應(yīng)變組(S組)以及二者協(xié)同作用組(P+S組)h PDLFs中β-catenin、Runx2、Wnt5a和Ror2表達(dá)的變化情況。結(jié)果:1.采用酶消化法能夠在體外成功培養(yǎng)出人牙周膜成纖維細(xì)胞。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示細(xì)胞抗波形絲蛋白染色陽(yáng)性,抗角蛋白染色陰性,證明為中胚層來(lái)源的人牙周膜成纖維細(xì)胞。2.RT-PCR結(jié)果顯示,隨時(shí)間推移,無(wú)論是單純加力組,還是P.g LPS與力共同作用組,在本實(shí)驗(yàn)所選的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn),即從0.5h到2h到4h,β-catenin、Runx2、Wnt5a和Ror2 m RNA的表達(dá)均經(jīng)歷了先升高后降低或先降低后升高的變化趨勢(shì),確定2h為最佳加力時(shí)長(zhǎng)。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,當(dāng)加力時(shí)長(zhǎng)確定為2h時(shí),與C組相比,P組β-catenin表達(dá)增加(PCR:P0.05;WB:P0.05),Runx2表達(dá)下降(P0.05),Wnt5a、Ror2表達(dá)增加(P0.05);S組β-catenin、Runx2、Wnt5a、Ror2表達(dá)均增加(P0.05);P+S組β-catenin、Runx2表達(dá)下降(P0.05),Wnt5a表達(dá)下降(PCR:P0.05;WB:P0.05),Ror2表達(dá)增加(P0.05)。與P組相比,P+S組β-catenin、Runx2、Wnt5a表達(dá)下降(P0.05),Ror2表達(dá)增加(P0.05)。結(jié)論:1.選擇符合納入標(biāo)準(zhǔn)的健康雙尖牙,采用酶消化法體外培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞,短期內(nèi)即獲得大量純度較高的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,細(xì)胞生長(zhǎng)代謝旺盛,對(duì)干預(yù)反應(yīng)良好,滿足實(shí)驗(yàn)需要。培養(yǎng)過(guò)程中注意無(wú)菌操作,取材部位嚴(yán)格,刮取組織力度適當(dāng),以及消化時(shí)間的控制是確保牙周膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。2.隨施力時(shí)間加長(zhǎng),經(jīng)或未經(jīng)P.g LPS處理的人牙周膜成纖維細(xì)胞,Wnt通路相關(guān)分子包括β-catenin、Runx2、Wnt5a和Ror2 m RNA的表達(dá)均經(jīng)歷了先升高后降低或先降低后升高的變化趨勢(shì),表示兩種微環(huán)境下的牙周膜成纖維細(xì)胞在受到牽張力后的應(yīng)激過(guò)程中,經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt通路可能均起了一定的作用。單軸循環(huán)拉伸應(yīng)變可激活經(jīng)典Wnt/β-catenin通路和非經(jīng)典Wnt5a/Ror2通路,P.g LPS同樣激活Wnt5a/Ror2通路,而Runx2表達(dá)變化卻完全相反,表明Wnt通路在不同微環(huán)境下激活可能會(huì)有成骨或破骨截然相反的效應(yīng),具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究;二者協(xié)同作用時(shí)激活Ror2相關(guān)的非經(jīng)典Wnt通路,而經(jīng)典Wnt通路受到一定程度抑制,Runx2表達(dá)量最低,這些可能與機(jī)械力加重炎性牙周組織骨破壞有關(guān)。為咬合創(chuàng)傷加重未經(jīng)控制的牙周炎患者的骨吸收提供理論依據(jù)。
【圖文】：

代人牙周膜成纖維細(xì)胞（×40）

人牙周膜成纖維細(xì)胞的形態(tài)察，7-10 天左右人牙周膜成纖維細(xì)胞開(kāi)放射狀排列，長(zhǎng)梭形或星形（圖 1）。圖 1 4 代人牙周膜成纖維細(xì)胞（×40）定人牙周膜成纖維細(xì)胞示，細(xì)胞抗波形絲蛋白染色胞漿棕黃色色，，染色陰性（圖 3）。證明實(shí)驗(yàn)細(xì)胞來(lái)
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R781.4

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本文編號(hào)：2648208