【摘要】： 近年來以生長因子局部應用為代表的牙周再生治療受到廣泛關注和研究。骨誘導形成蛋白-2(BMP2)是唯一能夠單獨誘導成骨的生長因子,在牙周組織中的分子調(diào)節(jié)作用也已經(jīng)比較明確。它可誘導牙周組織中未分化間充質(zhì)細胞分化為成骨細胞和成牙骨質(zhì)細胞,對人牙周膜成纖維細胞(HPDLFs)具有成骨定向分化誘導作用,但局部直接使用時存在著易流失、效率低等問題�；蛑委熂夹g(shù)的應用可以使外源性的BMP2直接在宿主細胞內(nèi)完成表達和后加工,減少全身的毒副作用,增強了局部治療效果,為牙周組織再生提供了廣闊的研究前景。導入方法的選擇是決定基因治療效果的關鍵因素。超聲微泡轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為一種新型的、安全有效的基因轉(zhuǎn)染方法,目前已應用于心臟、血管、肝臟、腎臟、骨骼肌、眼等領域的基因轉(zhuǎn)染實驗研究中,已有大量研究表明,超聲介導微泡造影劑破裂可增強目的基因在體內(nèi)外的轉(zhuǎn)染與表達。但該技術(shù)用于人牙周組織的報道較少,本課題以hBMP2為目的基因?qū)⒊曃⑴蒉D(zhuǎn)基因技術(shù)用于轉(zhuǎn)染HPDLFs,并觀察轉(zhuǎn)染后目的基因在HPDLFs中的表達情況,為該技術(shù)在牙周再生基因治療方面的進一步研究奠定實驗基礎。 目的: 構(gòu)建帶有目的基因hBMP2的真核表達載體pEGFP-N1-BMP2,然后利用超聲微泡轉(zhuǎn)基因技術(shù)將其轉(zhuǎn)入HPDLFs,并檢測轉(zhuǎn)染后目的基因的表達情況。 方法: 1.采用組織塊法原代培養(yǎng)HPDLFs,通過形態(tài)學及免疫組織化學鑒定后,進行傳代培養(yǎng),取3～5代細胞用于實驗。 2.根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中hBMP2的cDNA序列(Gen-Bank,Accession No.NM001200),利用Primer Premier 5設計軟件設計并合成引物,從人胎盤滋養(yǎng)層細胞系中提取總RNA,采用RT-PCR方法獲得hBMP2基因,連接pMD19-T載體后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a并篩選陽性克隆,經(jīng)酶切鑒定及測序正確后,用EcoRⅠ和BamH I限制性內(nèi)切酶分別雙酶切pMD19-T-BMP2與pEGFP-N1質(zhì)粒,再將回收、純化后的BMP2基因和pEGFP-N1質(zhì)粒進行連接、轉(zhuǎn)化,篩選pEGFP-N1-BMP2的陽性克隆,鑒定正確后用于后續(xù)實驗。 3.利用超聲微泡轉(zhuǎn)基因技術(shù),在聲強為0.5 w/cm~2,間斷波輻照時間60 s,微泡濃度為15%的條件下將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-BMP2轉(zhuǎn)入HPDLFs中,同時以在相同條件下轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1組及未轉(zhuǎn)染組做對照,通過熒光顯微鏡,RT-PCR和免疫熒光技術(shù)分別檢測轉(zhuǎn)染后HPDLFs中BMP2的表達情況。 結(jié)果: 1.牙周膜成纖維細胞原代培養(yǎng)成功并傳代。 2.成功克隆人BMP2基因,構(gòu)建了真核表達載體pEGFP-N1-BMP2。 3.超聲微泡轉(zhuǎn)基因技術(shù)在適當?shù)臈l件下可將攜帶目的基因BMP2的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-BMP2成功轉(zhuǎn)入HPDLFs;經(jīng)RT-PCR及免疫熒光檢測顯示,與對照組相比pEGFP-N1-BMP2轉(zhuǎn)染組中BMP2在HPDLFs內(nèi)的瞬時表達明顯增強。 結(jié)論:成功構(gòu)建pEGFP-N1-BMP2真核表達載體,并通過超聲微泡轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入HPDLFs,增強了hBMP2在HPDLFs中的表達,為進一步研究該載體與超聲微泡轉(zhuǎn)基因技術(shù)在牙周再生基因治療中的應用提供實驗基礎。
【圖文】：

切后 1%瓊脂糖凝膠電泳，可見約 1200 bp 和約 4700bp 出現(xiàn)條帶，與 BMP2 (1190bp)和 pEGFP-N1 載體（4700bp）大小相符。且雙酶切后的 BMP2 條帶與 RT-PCR 擴圖2-1: 胎盤滋養(yǎng)層細胞總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig2-1: 1% agarose gel electrophoresis analysisof total RNA of trophoblast cells from humanplacenta圖 2-2: RT-PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig2-2:1%agarose gel electrophoresisanalysis of RT-PCR products1. Bio Marker Ⅲ; 2. hBMP2

盤滋養(yǎng)層細胞總 RNA 含量測定及純度分析：分光光度計檢測，所提總 RNA 濃度約為 0.636 μg/μL，OD260/O1％瓊脂糖凝膠電泳可見 28S、18S 和 5S 三個條帶（圖 2-1），各，說明所提 RNA 質(zhì)量和豐度均很高。MP2基因全長 cDNA 擴增人胎盤滋養(yǎng)層細胞總 RNA 為模板，hBMP2 的 P1、P2 為引物，經(jīng)，其產(chǎn)物進行 1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示在 1200 bp 左右有特大小與預期相符合，提示擴增產(chǎn)物為 BMP2 基因片段。(圖 2-2)。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R781.4

【參考文獻】

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