【摘要】： 近年來以生長因子局部應(yīng)用為代表的牙周再生治療受到廣泛關(guān)注和研究。骨誘導(dǎo)形成蛋白-2(BMP2)是唯一能夠單獨(dú)誘導(dǎo)成骨的生長因子,在牙周組織中的分子調(diào)節(jié)作用也已經(jīng)比較明確。它可誘導(dǎo)牙周組織中未分化間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞,對人牙周膜成纖維細(xì)胞(HPDLFs)具有成骨定向分化誘導(dǎo)作用,但局部直接使用時(shí)存在著易流失、效率低等問題�；蛑委熂夹g(shù)的應(yīng)用可以使外源性的BMP2直接在宿主細(xì)胞內(nèi)完成表達(dá)和后加工,減少全身的毒副作用,增強(qiáng)了局部治療效果,為牙周組織再生提供了廣闊的研究前景。導(dǎo)入方法的選擇是決定基因治療效果的關(guān)鍵因素。超聲微泡轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為一種新型的、安全有效的基因轉(zhuǎn)染方法,目前已應(yīng)用于心臟、血管、肝臟、腎臟、骨骼肌、眼等領(lǐng)域的基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)研究中,已有大量研究表明,超聲介導(dǎo)微泡造影劑破裂可增強(qiáng)目的基因在體內(nèi)外的轉(zhuǎn)染與表達(dá)。但該技術(shù)用于人牙周組織的報(bào)道較少,本課題以hBMP2為目的基因?qū)⒊曃⑴蒉D(zhuǎn)基因技術(shù)用于轉(zhuǎn)染HPDLFs,并觀察轉(zhuǎn)染后目的基因在HPDLFs中的表達(dá)情況,為該技術(shù)在牙周再生基因治療方面的進(jìn)一步研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 目的: 構(gòu)建帶有目的基因hBMP2的真核表達(dá)載體pEGFP-N1-BMP2,然后利用超聲微泡轉(zhuǎn)基因技術(shù)將其轉(zhuǎn)入HPDLFs,并檢測轉(zhuǎn)染后目的基因的表達(dá)情況。 方法: 1.采用組織塊法原代培養(yǎng)HPDLFs,通過形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)鑒定后,進(jìn)行傳代培養(yǎng),取3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 2.根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中hBMP2的cDNA序列(Gen-Bank,Accession No.NM001200),利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)并合成引物,從人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞系中提取總RNA,采用RT-PCR方法獲得hBMP2基因,連接pMD19-T載體后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a并篩選陽性克隆,經(jīng)酶切鑒定及測序正確后,用EcoRⅠ和BamH I限制性內(nèi)切酶分別雙酶切pMD19-T-BMP2與pEGFP-N1質(zhì)粒,再將回收、純化后的BMP2基因和pEGFP-N1質(zhì)粒進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化,篩選pEGFP-N1-BMP2的陽性克隆,鑒定正確后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 3.利用超聲微泡轉(zhuǎn)基因技術(shù),在聲強(qiáng)為0.5 w/cm~2,間斷波輻照時(shí)間60 s,微泡濃度為15%的條件下將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-BMP2轉(zhuǎn)入HPDLFs中,同時(shí)以在相同條件下轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1組及未轉(zhuǎn)染組做對照,通過熒光顯微鏡,RT-PCR和免疫熒光技術(shù)分別檢測轉(zhuǎn)染后HPDLFs中BMP2的表達(dá)情況。 結(jié)果: 1.牙周膜成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)成功并傳代。 2.成功克隆人BMP2基因,構(gòu)建了真核表達(dá)載體pEGFP-N1-BMP2。 3.超聲微泡轉(zhuǎn)基因技術(shù)在適當(dāng)?shù)臈l件下可將攜帶目的基因BMP2的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-BMP2成功轉(zhuǎn)入HPDLFs;經(jīng)RT-PCR及免疫熒光檢測顯示,與對照組相比pEGFP-N1-BMP2轉(zhuǎn)染組中BMP2在HPDLFs內(nèi)的瞬時(shí)表達(dá)明顯增強(qiáng)。 結(jié)論:成功構(gòu)建pEGFP-N1-BMP2真核表達(dá)載體,并通過超聲微泡轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入HPDLFs,增強(qiáng)了hBMP2在HPDLFs中的表達(dá),為進(jìn)一步研究該載體與超聲微泡轉(zhuǎn)基因技術(shù)在牙周再生基因治療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【圖文】：

切后 1%瓊脂糖凝膠電泳，可見約 1200 bp 和約 4700bp 出現(xiàn)條帶，與 BMP2 (1190bp)和 pEGFP-N1 載體（4700bp）大小相符。且雙酶切后的 BMP2 條帶與 RT-PCR 擴(kuò)圖2-1: 胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig2-1: 1% agarose gel electrophoresis analysisof total RNA of trophoblast cells from humanplacenta圖 2-2: RT-PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig2-2:1%agarose gel electrophoresisanalysis of RT-PCR products1. Bio Marker Ⅲ; 2. hBMP2

盤滋養(yǎng)層細(xì)胞總 RNA 含量測定及純度分析：分光光度計(jì)檢測，所提總 RNA 濃度約為 0.636 μg/μL，OD260/O1％瓊脂糖凝膠電泳可見 28S、18S 和 5S 三個(gè)條帶（圖 2-1），各，說明所提 RNA 質(zhì)量和豐度均很高。MP2基因全長 cDNA 擴(kuò)增人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞總 RNA 為模板，hBMP2 的 P1、P2 為引物，經(jīng)，其產(chǎn)物進(jìn)行 1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示在 1200 bp 左右有特大小與預(yù)期相符合，提示擴(kuò)增產(chǎn)物為 BMP2 基因片段。(圖 2-2)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R781.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2647627