【摘要】：目的腫瘤細胞氧化壓力的增高是導致線粒體和mt DNA病理改變的重要原因,但是活性氧自由基與mt DNA損傷及后續(xù)的生物學效應的關(guān)系還不清楚。本實驗利用細胞一步法定量PCR新方法分析和比較外源性活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)誘發(fā)腫瘤細胞mt DNA損傷和修復、拷貝數(shù)變化和細胞毒性反應的異同及動態(tài)變化過程。方法選用口腔癌中發(fā)病率較高,惡性程度較強的口腔鱗狀細胞癌SCC-25細胞株為實驗模型,利用細胞一步法裂解和超螺旋敏感性定量PCR(ss-q PCR)的方法同時分析和比較外源ROS和RNS誘發(fā)腫瘤細胞mt DNA損傷的效應,論證兩類不同活性自由基分子的異同。ROS以五個濃度H2O2(60-960μM),四個時間點(20 min,1 h,24 h,48 h)誘導細胞出現(xiàn)氧化損傷反應,RNS用林西多明(3-morpholino-sydnonimine,SIN-1)五個濃度(0.25-1 m M),四個時間點(1h,6 h,24 h,48 h)誘導細胞出現(xiàn)氧化損傷反應。通過ss-q PCR方法測定mt DNA損傷、修復的動態(tài)過程,細胞一步法微滴式數(shù)字PCR(dd PCR)方法用于測定細胞mt DNA拷貝數(shù)改變,MTT方法測定細胞活性與生長抑制,單細胞克隆實驗測定10天細胞存活率。結(jié)果本研究建立了細胞一步法定量PCR分析技術(shù),即細胞裂解后直接用于PCR,完全避免DNA的提取與純化,從而可在96-孔板中進行高通量快速分析。我們用實驗證明細胞一步法樣本處理不僅可與ss-q PCR結(jié)合進行mt DNA損傷與修復的快速分析,而且可與dd PCR結(jié)合進行細胞內(nèi)mt DNA拷貝數(shù)變化的絕對定量分析。利用細胞一步法ss-q PCR和dd PCR方法,本研究系統(tǒng)性分析了外源性H2O2誘發(fā)SCC-25口腔癌細胞mt DNA損傷、修復和拷貝數(shù)改變的動態(tài)變化過程,揭示出一個十分敏感的早期mt DNA損傷反應,一個區(qū)分可恢復性和不可逆性mt DNA損傷的閾值劑量;高劑量H2O2誘發(fā)的不可逆性mt DNA損傷是導致mt DNA拷貝數(shù)下降和細胞嚴重生長抑制和毒性的主要誘因之一,而mt DNA低劑量的可恢復性則與單細胞克隆的10天存活率相關(guān)。此外,我們首次證明外源性SIN-1(一個常用的過氧亞硝基陰離子(ONOO-)供體)可以在SCC-25細胞誘發(fā)一個早期劑量依賴性mt DNA損傷的增高,但是與H2O2不同,高劑量SIN-1誘發(fā)的不可逆損傷并不伴隨mt DNA拷貝數(shù)的改變。表明SIN-1可能通過與H2O2不同的機制誘發(fā)mt DNA的損傷。結(jié)論本研究建立的細胞一步法ss-q PCR和dd PCR分析方法為mt DNA的損傷、修復和拷貝數(shù)變化的系統(tǒng)分析提供了一個強有力的新技術(shù)平臺。本研究揭示了外源性H2O2可在SCC-25口腔癌細胞誘發(fā)一個十分獨特的mt DNA損傷、修復和拷貝數(shù)改變的動態(tài)變化過程,早期mt DNA損傷的程度和類型決定或指示后續(xù)細胞急性毒性和慢性存活率的不同應答反應。我們首次證明SIN-1可以在SCC-25細胞誘發(fā)一個早期劑量依賴性mt DNA損傷的增高,但與H2O2的作用方式不同。表明SIN-1可能通過與H2O2不同的機制誘發(fā)mt DNA的損傷和細胞毒性。
【圖文】：

圖 1 氧化刺激誘發(fā) SCC-25 腫瘤細胞 mtDNA 損傷和突變的實驗流程圖2、PCR 檢測 SCC-25 細胞 H2O2刺激損傷修復及拷貝數(shù)變化實驗步驟（1）細胞鋪板細胞計數(shù)，取 1x106細胞 1 ml 加入 9 ml 細胞培養(yǎng)液中，制成濃度為 1x105/ ml的 stock1。Stock1 中取 5 ml 溶入 10 ml 細胞培養(yǎng)液中，制成濃度約為 53333 cells/ ml 的工作液。工作液中每孔取 150 μl 即 33333x0.15=5000 個細胞，搖晃混勻，一列一列加。每板 6 個劑量，每個劑量 3 個重復細胞樣本。加完標記，，放于孵箱37℃，5% CO2條件培養(yǎng)，26 h 后刺激。（2）刺激處理刺激時間為20 min、1 h、24 h、48 h。刺激劑量為0 μM、60 μM、120 μM、240 μM、480 μM、960 μM。（3）樣本收集及檢測

本之間 2 倍的差別，在對照樣本中獲得 mtDNA 損傷基值低、重復性好且不受細胞數(shù)量影響的定量分析結(jié)果，為基于 96-孔板的高通量分析提供了可行性。圖2 細胞一步法 qPCR 分析不同數(shù)量SCC-25 口腔癌細胞線粒體DNA 的擴增曲線與 Ct 值注：箭頭所指擴增曲線分別為 500、1000、2000、4000 和 8000 個 SCC-25 口腔癌細胞樣本，Ct 值為擴增曲線與基值交匯處的 PCR 循環(huán)數(shù)，NTC 代表無模板陰性對照。Y 軸代表擴增子熒光強度（ Rn），X 軸代表定量 PCR 循環(huán)次數(shù)（cycle）。
【學位授予單位】：錦州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.8

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 盧雪;陳蓉;杜鳳;唐卓;;一種利用活性炭提取中藥材DNA的方法[J];天然產(chǎn)物研究與開發(fā);年期

2 張志霞;高莉;劉倩倩;曹素娟;蘭利瓊;卿人韋;;適用于流式細胞術(shù)的三角褐指藻核DNA染色方法[J];應用與環(huán)境生物學報;年期

3 朱爽;陳閃沖;李奇威;黃曉瑩;章衛(wèi)民;吳光明;高曉霞;;基于DNA條形碼的三種沉香屬物種鑒定研究[J];中藥材;2018年05期

4 李萌;李翔;龐曉明;李穎岳;;珍稀樹種廟臺槭不同組織DNA高效提取方法分析[J];分子植物育種;年期

5 石玉波;錢長根;卓麗環(huán);王玲;;百子蓮花芽分化過程中DNA甲基化的差異分析[J];北方園藝;年期

6 陳芳;殷志祥;;最大團問題的三鏈DNA計算模型[J];安慶師范大學學報(自然科學版);2018年03期

7 風蘭;李國瑞;黃鳳蘭;白英俊;李孟建;孫佳欣;韓雯毓;陳永勝;;蓖麻基因組DNA提取方法研究進展[J];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技;2018年17期

8 徐鑫;邊勇;陳哲;孫悅;劉子璐;胡渤洋;武揚;張國慶;;基于DNA條形碼的桑黃真菌分子鑒定[J];北京農(nóng)學院學報;2019年01期

9 朱巍巍;李莉;陳飛;李楊;王艷華;包永明;;基因組DNA去甲基化法改良蛹蟲草菌株高產(chǎn)蟲草素及性狀穩(wěn)定性評價[J];生物技術(shù)通報;2016年12期

10 賀爾奇;Pan Yong-Bao;付瑜華;雷石富;李向勇;盧加舉;張正學;;9個果蔗品種(系)遺傳多樣性分析及DNA指紋圖譜構(gòu)建[J];南方農(nóng)業(yè)學報;2016年11期

相關(guān)會議論文 前10條

1 劉冰;王旭;趙夢真;晁潔;樊春海;;基于DNA折紙術(shù)的納米金棒精密修飾[A];中國化學會第30屆學術(shù)年會摘要集-第二十八分會：化學生物學[C];2016年

2 劉冬生;李闖;程恩雋;邢永政;金娟;;DNA超分子水凝膠及其應用[A];中國化學會第30屆學術(shù)年會摘要集-第二十四分會：超分子組裝與軟物質(zhì)材料[C];2016年

3 Kaiying Cheng;Hong Xu;Xuanyi Chen;Liangyan Wang;Bing Tian;Ye Zhao;Yuejin Hua;;Structural basis for DNA 5′-end resection by RecJ[A];第五屆中國結(jié)構(gòu)生物學學術(shù)討論會摘要集[C];2016年

4 陳南迪;覃詩雅;羊小海;王青;翦立新;王柯敏;;“傳感-治療”的DNA納米裝置在協(xié)同殺傷循環(huán)腫瘤細胞的應用[A];中國化學會第30屆學術(shù)年會摘要集-第三十八分會：納米生物效應與納米藥物化學[C];2016年

5 劉曄華;陳錦艷;江雁;張堅磊;穆紅;;磁珠法提取金黃色葡萄球菌基因組DNA的評價[A];第七屆中國臨床微生物學大會暨微生物學與免疫學論壇論文匯編[C];2016年

6 譚磊;孫悅;周湘;劉偉;;多頭蚴核糖體DNA及線粒體DNA多態(tài)性研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)寄生蟲學分會第十三次學術(shù)研討會論文集[C];2015年

7 葉俏;沈潔;嚴婷婷;王宙政;;原發(fā)性干燥綜合征患者血漿循環(huán)DNA與疾病活動相關(guān)性研究[A];2015年浙江省風濕病學學術(shù)年會論文匯編[C];2015年

8 周嘉嘉;FriederikeSchmid;;計算模擬研究DNA和聚電解質(zhì)的結(jié)合[A];2015年全國高分子學術(shù)論文報告會論文摘要集——主題E 高分子理論計算模擬[C];2015年

9 Yuan Zhang;Yanlong Chen;Gaigai Xu;Chen Lan;Shaige Xia;Wenjie Zhao;Shusheng Zhang;;Endogenous DNA adducts method establishment and Human Biomonitoring[A];河南省化學會2016年學術(shù)年會論文摘要集[C];2016年

10 孫覓;辛麗斐;劉宏;;基于濃差電池原理高靈敏檢測DNA的傳感器[A];中國化學會第30屆學術(shù)年會摘要集-第四分會：生物分析和生物傳感[C];2016年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 本報記者 辛明;鄧亞軍：災難現(xiàn)場的DNA斗士[N];中國青年報;2011年

2 本報記者 歐陽曉紅　韓宋輝;“可怕”的友邦DNA 267億港元凈利從何而來[N];經(jīng)濟觀察報;2015年

3 本報記者 陸成寬;DNA到底能不能預測外貌[N];科技日報;2018年

4 陸成寬;DNA到底能不能預測外貌[N];科學導報;2018年

5 記者 劉霞;人體細胞內(nèi)存在全新DNA結(jié)構(gòu)[N];科技日報;2018年

6 強天林 王佳樂;DNA存儲技術(shù)：掌握信息控制權(quán)的利器[N];解放軍報;2018年

7 柯文;人體細胞內(nèi)存在全新DNA結(jié)構(gòu)[N];江蘇科技報;2018年

8 本報記者 秦珍子;是不是另一半，DNA說了算？[N];中國青年報;2014年

9 記者 聶翠蓉;DNA開關(guān)能調(diào)控單個分子內(nèi)電流[N];科技日報;2017年

10 記者 何屹;DNA“條形碼”可快速定位體內(nèi)納米粒子[N];科技日報;2017年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 王文娟;非天然核苷酸的組裝及其DNA鏈的結(jié)構(gòu)性能研究[D];山東師范大學;2018年

2 石元元;豬繁殖與呼吸綜合征病毒通過DNA甲基化限制IRF3上調(diào)表達的機制及其在先天性抗病毒免疫中的作用[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2017年

3 王敏;血漿細胞游離DNA在婦科惡性腫瘤中的應用價值研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學院;2018年

4 徐曲毅;溺死相關(guān)浮游生物DNA檢測技術(shù)研究[D];廣東工業(yè)大學;2018年

5 王偉;單鏈和雙鏈DNA結(jié)合蛋白特征提取與分類研究[D];武漢大學;2014年

6 黃維;基于液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用的DNA/RNA修飾分析[D];武漢大學;2016年

7 劉世恩;針對代謝酶（PHGDH和PGAM1）與胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）的藥物設計和機制研究[D];中國科學院大學(中國科學院上海藥物研究所);2017年

8 劉云龍;基因標志物數(shù)字化檢測新方法研究[D];南京大學;2017年

9 徐非;Beclin 1蛋白通過核定位以一種不依賴于自噬的方式參與輻照引起的DNA損傷修復[D];蘇州大學;2017年

10 李鋒;組蛋白去甲基化酶Rph1在DNA損傷中的功能及調(diào)控機制[D];武漢大學;2016年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 于媛媛;菊花基因組DNA甲基化水平對根系硝態(tài)氮吸收的影響[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2018年

2 劉小英;動力學方法探討PaP1 DNA聚合酶Gp90跨DNA脫堿基損傷的機制[D];新疆醫(yī)科大學;2018年

3 李晶晶;維吾爾族初發(fā)2型糖尿病患者易感基因DNA甲基化修飾研究[D];新疆醫(yī)科大學;2018年

4 李志;基于DNA探針構(gòu)建的生物傳感技術(shù)檢測腫瘤標志物及腫瘤細胞[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2018年

5 何暮春;頭足類DNA甲基化水平及其動態(tài)變化規(guī)律[D];浙江海洋大學;2018年

6 任明;細胞內(nèi)尿嘧啶-DNA糖基化酶的超靈敏檢測研究[D];山東師范大學;2018年

7 姜文凈;基于納米發(fā)光材料的電致發(fā)光傳感器檢測DNA羥甲基化[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2018年

8 謝新文;DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ抑制劑的設計合成及抗腫瘤活性的初步研究[D];山東大學;2018年

9 鄭悅;黃色粘球菌生物被膜中胞外DNA的整合機制與生物學功能[D];山東大學;2018年

10 馬詩詩;基于熒光標記DNA與聚合物納米材料相互作用的神經(jīng)退行性疾病相關(guān)靶標分析方法研究[D];華東師范大學;2018年

本文編號：2647553