發(fā)布時(shí)間：2020-05-03 12:49

【摘要】：目的腫瘤細(xì)胞氧化壓力的增高是導(dǎo)致線粒體和mt DNA病理改變的重要原因,但是活性氧自由基與mt DNA損傷及后續(xù)的生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)系還不清楚。本實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞一步法定量PCR新方法分析和比較外源性活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)誘發(fā)腫瘤細(xì)胞mt DNA損傷和修復(fù)、拷貝數(shù)變化和細(xì)胞毒性反應(yīng)的異同及動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。方法選用口腔癌中發(fā)病率較高,惡性程度較強(qiáng)的口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC-25細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?利用細(xì)胞一步法裂解和超螺旋敏感性定量PCR(ss-q PCR)的方法同時(shí)分析和比較外源ROS和RNS誘發(fā)腫瘤細(xì)胞mt DNA損傷的效應(yīng),論證兩類(lèi)不同活性自由基分子的異同。ROS以五個(gè)濃度H2O2(60-960μM),四個(gè)時(shí)間點(diǎn)(20 min,1 h,24 h,48 h)誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)氧化損傷反應(yīng),RNS用林西多明(3-morpholino-sydnonimine,SIN-1)五個(gè)濃度(0.25-1 m M),四個(gè)時(shí)間點(diǎn)(1h,6 h,24 h,48 h)誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)氧化損傷反應(yīng)。通過(guò)ss-q PCR方法測(cè)定mt DNA損傷、修復(fù)的動(dòng)態(tài)過(guò)程,細(xì)胞一步法微滴式數(shù)字PCR(dd PCR)方法用于測(cè)定細(xì)胞mt DNA拷貝數(shù)改變,MTT方法測(cè)定細(xì)胞活性與生長(zhǎng)抑制,單細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)測(cè)定10天細(xì)胞存活率。結(jié)果本研究建立了細(xì)胞一步法定量PCR分析技術(shù),即細(xì)胞裂解后直接用于PCR,完全避免DNA的提取與純化,從而可在96-孔板中進(jìn)行高通量快速分析。我們用實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞一步法樣本處理不僅可與ss-q PCR結(jié)合進(jìn)行mt DNA損傷與修復(fù)的快速分析,而且可與dd PCR結(jié)合進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)mt DNA拷貝數(shù)變化的絕對(duì)定量分析。利用細(xì)胞一步法ss-q PCR和dd PCR方法,本研究系統(tǒng)性分析了外源性H2O2誘發(fā)SCC-25口腔癌細(xì)胞mt DNA損傷、修復(fù)和拷貝數(shù)改變的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程,揭示出一個(gè)十分敏感的早期mt DNA損傷反應(yīng),一個(gè)區(qū)分可恢復(fù)性和不可逆性mt DNA損傷的閾值劑量;高劑量H2O2誘發(fā)的不可逆性mt DNA損傷是導(dǎo)致mt DNA拷貝數(shù)下降和細(xì)胞嚴(yán)重生長(zhǎng)抑制和毒性的主要誘因之一,而mt DNA低劑量的可恢復(fù)性則與單細(xì)胞克隆的10天存活率相關(guān)。此外,我們首次證明外源性SIN-1(一個(gè)常用的過(guò)氧亞硝基陰離子(ONOO-)供體)可以在SCC-25細(xì)胞誘發(fā)一個(gè)早期劑量依賴性mt DNA損傷的增高,但是與H2O2不同,高劑量SIN-1誘發(fā)的不可逆損傷并不伴隨mt DNA拷貝數(shù)的改變。表明SIN-1可能通過(guò)與H2O2不同的機(jī)制誘發(fā)mt DNA的損傷。結(jié)論本研究建立的細(xì)胞一步法ss-q PCR和dd PCR分析方法為mt DNA的損傷、修復(fù)和拷貝數(shù)變化的系統(tǒng)分析提供了一個(gè)強(qiáng)有力的新技術(shù)平臺(tái)。本研究揭示了外源性H2O2可在SCC-25口腔癌細(xì)胞誘發(fā)一個(gè)十分獨(dú)特的mt DNA損傷、修復(fù)和拷貝數(shù)改變的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程,早期mt DNA損傷的程度和類(lèi)型決定或指示后續(xù)細(xì)胞急性毒性和慢性存活率的不同應(yīng)答反應(yīng)。我們首次證明SIN-1可以在SCC-25細(xì)胞誘發(fā)一個(gè)早期劑量依賴性mt DNA損傷的增高,但與H2O2的作用方式不同。表明SIN-1可能通過(guò)與H2O2不同的機(jī)制誘發(fā)mt DNA的損傷和細(xì)胞毒性。
【圖文】：

圖 1 氧化刺激誘發(fā) SCC-25 腫瘤細(xì)胞 mtDNA 損傷和突變的實(shí)驗(yàn)流程圖2、PCR 檢測(cè) SCC-25 細(xì)胞 H2O2刺激損傷修復(fù)及拷貝數(shù)變化實(shí)驗(yàn)步驟（1）細(xì)胞鋪板細(xì)胞計(jì)數(shù)，取 1x106細(xì)胞 1 ml 加入 9 ml 細(xì)胞培養(yǎng)液中，制成濃度為 1x105/ ml的 stock1。Stock1 中取 5 ml 溶入 10 ml 細(xì)胞培養(yǎng)液中，制成濃度約為 53333 cells/ ml 的工作液。工作液中每孔取 150 μl 即 33333x0.15=5000 個(gè)細(xì)胞，搖晃混勻，一列一列加。每板 6 個(gè)劑量，每個(gè)劑量 3 個(gè)重復(fù)細(xì)胞樣本。加完標(biāo)記，，放于孵箱37℃，5% CO2條件培養(yǎng)，26 h 后刺激。（2）刺激處理刺激時(shí)間為20 min、1 h、24 h、48 h。刺激劑量為0 μM、60 μM、120 μM、240 μM、480 μM、960 μM。（3）樣本收集及檢測(cè)

本之間 2 倍的差別，在對(duì)照樣本中獲得 mtDNA 損傷基值低、重復(fù)性好且不受細(xì)胞數(shù)量影響的定量分析結(jié)果，為基于 96-孔板的高通量分析提供了可行性。圖2 細(xì)胞一步法 qPCR 分析不同數(shù)量SCC-25 口腔癌細(xì)胞線粒體DNA 的擴(kuò)增曲線與 Ct 值注：箭頭所指擴(kuò)增曲線分別為 500、1000、2000、4000 和 8000 個(gè) SCC-25 口腔癌細(xì)胞樣本，Ct 值為擴(kuò)增曲線與基值交匯處的 PCR 循環(huán)數(shù)，NTC 代表無(wú)模板陰性對(duì)照。Y 軸代表擴(kuò)增子熒光強(qiáng)度（ Rn），X 軸代表定量 PCR 循環(huán)次數(shù)（cycle）。
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R739.8

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本文編號(hào)：2647553