【摘要】： 牙齒萌出是一個(gè)復(fù)雜且受到嚴(yán)密調(diào)控的過(guò)程。大量研究表明,牙囊在牙齒萌出中發(fā)揮重要的作用,其中一個(gè)重要原因就是牙囊中含有一系列牙齒萌出所必需的調(diào)控因子,包括巨噬細(xì)胞集落刺激因子-1(CSF-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)等,它們能夠趨化單核細(xì)胞進(jìn)入牙囊并促使其形成破骨細(xì)胞,后者吸收牙槽骨形成牙齒萌出通道。 Wise等在研究大鼠牙齒萌出過(guò)程中發(fā)現(xiàn):破骨細(xì)胞的形成在大鼠出生后3d達(dá)到一個(gè)高峰期,此時(shí)牙囊中的一些牙齒萌出調(diào)控因子如CSF-1、MCP-1的表達(dá)均達(dá)到高峰,表明CSF-1、MCP-1在破骨細(xì)胞形成這一高峰期發(fā)揮重要的作用。但是Wise發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞的形成在大鼠出生后10d左右又達(dá)到一個(gè)高峰,而此時(shí)牙囊中CSF-1、MCP-1等的表達(dá)均大大降低,因此Wise等推測(cè)在第二個(gè)高峰期有另外一些因子促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成。2003年Wise等研究發(fā)現(xiàn)在大鼠出生后10d左右,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在牙囊中的表達(dá)達(dá)到高峰,推測(cè)VEGF在破骨細(xì)胞形成的第二個(gè)高峰期發(fā)揮重要作用。他們?cè)陔S后又進(jìn)行了一些研究,證實(shí)了他們的推測(cè)。 但是Wise等的研究結(jié)果是基于嚙齒動(dòng)物的實(shí)驗(yàn),其結(jié)論是否適用于人類的牙齒萌出還不確定,而且目前有關(guān)VEGF在牙齒萌出中作用的研究還缺乏系統(tǒng)性。許多問(wèn)題如體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞能否表達(dá)VEGF、VEGF對(duì)人牙囊細(xì)胞的生物學(xué)作用及可能機(jī)制、其它牙齒萌出相關(guān)分子對(duì)人牙囊細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響、調(diào)控人牙囊細(xì)胞VEGF表達(dá)的信號(hào)通路、VEGF對(duì)人牙囊細(xì)胞OPG、RANKL表達(dá)的影響等均還不清楚。 本課題將在以往研究的基礎(chǔ)上,通過(guò)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞,采用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)有關(guān)方法,比較系統(tǒng)地研究人牙囊細(xì)胞VEGF表達(dá)及可能信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制、VEGF對(duì)人牙囊細(xì)胞增殖、分化、凋亡的影響及可能機(jī)制、VEGF參與牙齒萌出過(guò)程中破骨細(xì)胞形成和分化的機(jī)理等,以探討VEGF參與牙齒萌出的生物學(xué)機(jī)制。本課題的結(jié)果將有助于闡明牙齒萌出的分子機(jī)制,也為臨床阻生牙的正畸矯治以及牙胚的組織工程研究等提供理論基礎(chǔ)。 本課題的研究?jī)?nèi)容如下: 第一部分:體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞VEGF的表達(dá) 目的:觀察體外培養(yǎng)的人牙囊細(xì)胞能否表達(dá)VEGF。方法:取一名12歲男孩因正畸需要拔除的下頜第三磨牙的牙囊組織,采用組織塊和酶消化相結(jié)合的方法體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞,觀察細(xì)胞形態(tài),并選取第4代細(xì)胞進(jìn)行波形絲蛋白和角蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定其細(xì)胞來(lái)源。然后選取第4代人牙囊細(xì)胞,采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)三種方法檢測(cè)VEGF的表達(dá)。結(jié)果:在體外成功培養(yǎng)出人牙囊細(xì)胞,絕大多數(shù)細(xì)胞呈典型的成纖維樣細(xì)胞形態(tài),抗波形絲蛋白染色陽(yáng)性,抗角蛋白染色陰性,證明細(xì)胞來(lái)源于外胚間充質(zhì)。人牙囊細(xì)胞抗VEGF染色陽(yáng)性,陽(yáng)性部位位于胞漿。RT-PCR檢測(cè)到人牙囊細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá)。在人牙囊細(xì)胞培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到VEGF蛋白。結(jié)論:用組織塊結(jié)合酶消化法在體外成功培養(yǎng)出人牙囊細(xì)胞,經(jīng)鑒定細(xì)胞來(lái)源于外胚間充質(zhì)。體外培養(yǎng)的人牙囊細(xì)胞能夠合成并分泌VEGF。 第二部分:VEGF對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 目的:觀察VEGF對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞增殖、分化、凋亡的影響并探討可能的作用機(jī)制。方法:將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第4代人牙囊細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板上,分別與不同濃度的VEGF孵育3d或與100ng/mL VEGF孵育不同時(shí)間,檢測(cè)VEGF對(duì)人牙囊細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶活性的影響。將VEGF和MAPK抑制劑不同組合加入到96孔培養(yǎng)板的細(xì)胞中,檢測(cè)MAPK抑制劑對(duì)VEGF介導(dǎo)的牙囊細(xì)胞增殖的作用。采用流式細(xì)胞儀技術(shù)觀察VEGF對(duì)人牙囊細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)果:VEGF在10~300ng/mL范圍內(nèi)能明顯提高人牙囊細(xì)胞的增殖水平和堿性磷酸酶活性(P0.01)。VEGF處理組人牙囊細(xì)胞的增殖水平在孵育后1、3、5、7d均明顯高于對(duì)照組(P0.01),而VEGF處理組人牙囊細(xì)胞堿性磷酸酶活性在孵育后3、5、7d明顯高于對(duì)照組(P0.01)。MAPK抑制劑能削弱VEGF介導(dǎo)的人牙囊細(xì)胞增殖。VEGF處理組人牙囊細(xì)胞的凋亡率略低于對(duì)照組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:VEGF在一定濃度范圍內(nèi)能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞的增殖,但無(wú)明顯抑制牙囊細(xì)胞凋亡的作用。MAPK信號(hào)通路是VEGF促進(jìn)人牙囊細(xì)胞增殖的一條可能途徑。VEGF還能促進(jìn)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞堿性磷酸酶活性的升高,提示VEGF可能是促使牙囊細(xì)胞向成骨細(xì)胞/成牙骨質(zhì)細(xì)胞表型分化的一種誘導(dǎo)因子。 第三部分:TNF-α、bFGF對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響 目的:研究TNF-α、bFGF對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響。方法:選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第4代人牙囊細(xì)胞,采用RT-PCR及ELISA分別檢測(cè)TNF-α(bFGF)對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)及上清液中VEGF含量改變的濃度和時(shí)間效應(yīng)。結(jié)果:①不同濃度TNF-α作用1h后, TNF-α處理組人牙囊細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)均較對(duì)照組增強(qiáng)(P0.05),最佳效應(yīng)濃度為25ng/mL;不同濃度TNF-α作用12h后,除1ng/mL組外,其余各組上清液中VEGF蛋白含量明顯高于對(duì)照組(P0.05)。②在時(shí)間效應(yīng)上,25ng/mL TNF-α作用1h后人牙囊細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)最強(qiáng),然后隨時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)逐漸下降,但仍強(qiáng)于對(duì)照組(P0.05);細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白含量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加,但TNF-α處理組VEGF蛋白含量高于對(duì)照組(P0.05)。③不同濃度bFGF作用6h后, bFGF處理組人牙囊細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)均較對(duì)照組增強(qiáng)(P0.05),最佳效應(yīng)濃度為10ng/mL;不同濃度bFGF作用12h后,bFGF處理組上清液中VEGF蛋白含量明顯高于對(duì)照組(P0.05)。④在時(shí)間效應(yīng)上,bFGF作用1、3、6、12h后人牙囊細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)均較對(duì)照組顯著增強(qiáng)(P0.01),其中bFGF作用6h后VEGF mRNA表達(dá)最強(qiáng);細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白含量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加,但bFGF處理組VEGF蛋白含量高于對(duì)照組(P0.01)。結(jié)論:TNF-α、bFGF能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞合成并分泌VEGF。 第四部分:PKC、cAMP/PKA信號(hào)通路在調(diào)控體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞VEGF表達(dá)中的作用 目的:探討PKC、cAMP/PKA信號(hào)通路在調(diào)控體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞VEGF表達(dá)中的作用。方法:選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第4代人牙囊細(xì)胞,采用Real-time PCR分別檢測(cè)PKC激動(dòng)劑(PMA)、PKC非特異性抑制劑(G?6983)、PKC-α和γ特異性抑制劑(HBDDE)、PKC-β特異性抑制劑(LY333531)、cAMP/PKA激動(dòng)劑(dbcAMP)和抑制劑(KT5720)對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果:PMA組和PMA+HBDDE組VEGF mRNA的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而PMA+G?6983組和PMA+LY333531組VEGF mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照組之間無(wú)明顯差異(P0.05)。dbcAMP組VEGF mRNA的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而dbcAMP+KT5720組VEGF mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照組之間無(wú)明顯差異(P0.05)。結(jié)論:PKC、cAMP/PKA信號(hào)通路均參與體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞VEGF表達(dá)的調(diào)控,其中PKC信號(hào)通路中參與調(diào)控的亞單位是PKC-β。 第五部分:VEGF對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞OPG、RANKL表達(dá)的影響 目的:探討VEGF對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞OPG、RANKL表達(dá)的影響。方法:將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第4代人牙囊細(xì)胞與25ng/mL VEGF孵育不同時(shí)間后,采用RT-PCR分別檢測(cè)OPG mRNA、RANKL mRNA表達(dá)的變化,采用ELISA檢測(cè)上清液中OPG蛋白含量變化。結(jié)果:人牙囊細(xì)胞與VEGF孵育6h后RANKL mRNA表達(dá)最強(qiáng),與對(duì)照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。其余各組RANKL mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組略有升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。人牙囊細(xì)胞與VEGF孵育1h后OPG mRNA表達(dá)水平開始下降,但與對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。孵育3h后OPG mRNA表達(dá)顯著降低,與對(duì)照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。以后OPG mRNA表達(dá)水平逐漸恢復(fù),與對(duì)照組之間無(wú)明顯差異(P0.05)。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中OPG蛋白含量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加,但VEGF處理組OPG蛋白含量低于對(duì)照組(P0.05)。結(jié)論:VEGF能夠抑制體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞OPG的表達(dá),促進(jìn)其RANKL的表達(dá),通過(guò)RANKL-RANK-OPG軸調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的形成和分化,參與牙齒萌出的調(diào)控。
【圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文165、189 和 206 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，所形成的 VEGF 同源二聚體分別稱VEGF121（缺少外顯子 6 和 7）、VEGF145（缺少外顯子 7）、VEGF165（少外顯子 6）、VEGF189（包含 8 個(gè)外顯子）和 VEGF206（包含所有外顯及部分第 7 內(nèi)含子）[74,77]（圖 1）。

圖 2 VEGF 受體的結(jié)構(gòu)示意圖在所有 VEGF 受體中，VEGFR-1 與 VEGF 的親和力最強(qiáng)，，但其酪氨酸激酶活性卻非常弱，而 VEGFR-2 雖然與 VEGF 親和力低，但其激酶活性并不弱于其它酪氨酸激酶型受體（如表皮生長(zhǎng)因子受體 EGFR）[88,89]。另外，最近研究發(fā)現(xiàn)只與 VEGF165 結(jié)合的受體 NRP-1 可以使 VEGF165 與 VEGFR-的結(jié)合力增強(qiáng) 10 倍以上[90]，這說(shuō)明 VEGF165 與 VEGFR-2 的結(jié)合及其后的信號(hào)傳導(dǎo)在 VEGF 促進(jìn)血管生成中可能起到較為關(guān)鍵的作用。研究發(fā)現(xiàn)VEGFR-2 在胚胎形成過(guò)程中對(duì)血管生成起較強(qiáng)的正性調(diào)控作用，而 VEGFR-則對(duì)血管形成主要起負(fù)性調(diào)節(jié)作用[91,92]。VEGFR-1 和 VEGFR-2 主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞上，其他細(xì)胞如造血細(xì)胞、單核細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨核細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞、視網(wǎng)膜祖細(xì)胞、NIH3T3
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R78

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本文編號(hào)：2641349