【摘要】： 牙齒萌出是一個復(fù)雜且受到嚴密調(diào)控的過程。大量研究表明,牙囊在牙齒萌出中發(fā)揮重要的作用,其中一個重要原因就是牙囊中含有一系列牙齒萌出所必需的調(diào)控因子,包括巨噬細胞集落刺激因子-1(CSF-1)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)等,它們能夠趨化單核細胞進入牙囊并促使其形成破骨細胞,后者吸收牙槽骨形成牙齒萌出通道。 Wise等在研究大鼠牙齒萌出過程中發(fā)現(xiàn):破骨細胞的形成在大鼠出生后3d達到一個高峰期,此時牙囊中的一些牙齒萌出調(diào)控因子如CSF-1、MCP-1的表達均達到高峰,表明CSF-1、MCP-1在破骨細胞形成這一高峰期發(fā)揮重要的作用。但是Wise發(fā)現(xiàn)破骨細胞的形成在大鼠出生后10d左右又達到一個高峰,而此時牙囊中CSF-1、MCP-1等的表達均大大降低,因此Wise等推測在第二個高峰期有另外一些因子促進破骨細胞的形成。2003年Wise等研究發(fā)現(xiàn)在大鼠出生后10d左右,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在牙囊中的表達達到高峰,推測VEGF在破骨細胞形成的第二個高峰期發(fā)揮重要作用。他們在隨后又進行了一些研究,證實了他們的推測。 但是Wise等的研究結(jié)果是基于嚙齒動物的實驗,其結(jié)論是否適用于人類的牙齒萌出還不確定,而且目前有關(guān)VEGF在牙齒萌出中作用的研究還缺乏系統(tǒng)性。許多問題如體外培養(yǎng)人牙囊細胞能否表達VEGF、VEGF對人牙囊細胞的生物學作用及可能機制、其它牙齒萌出相關(guān)分子對人牙囊細胞VEGF表達的影響、調(diào)控人牙囊細胞VEGF表達的信號通路、VEGF對人牙囊細胞OPG、RANKL表達的影響等均還不清楚。 本課題將在以往研究的基礎(chǔ)上,通過體外培養(yǎng)人牙囊細胞,采用細胞生物學和分子生物學有關(guān)方法,比較系統(tǒng)地研究人牙囊細胞VEGF表達及可能信號調(diào)節(jié)機制、VEGF對人牙囊細胞增殖、分化、凋亡的影響及可能機制、VEGF參與牙齒萌出過程中破骨細胞形成和分化的機理等,以探討VEGF參與牙齒萌出的生物學機制。本課題的結(jié)果將有助于闡明牙齒萌出的分子機制,也為臨床阻生牙的正畸矯治以及牙胚的組織工程研究等提供理論基礎(chǔ)。 本課題的研究內(nèi)容如下: 第一部分:體外培養(yǎng)人牙囊細胞VEGF的表達 目的:觀察體外培養(yǎng)的人牙囊細胞能否表達VEGF。方法:取一名12歲男孩因正畸需要拔除的下頜第三磨牙的牙囊組織,采用組織塊和酶消化相結(jié)合的方法體外培養(yǎng)人牙囊細胞,觀察細胞形態(tài),并選取第4代細胞進行波形絲蛋白和角蛋白免疫細胞化學染色鑒定其細胞來源。然后選取第4代人牙囊細胞,采用免疫細胞化學染色、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)三種方法檢測VEGF的表達。結(jié)果:在體外成功培養(yǎng)出人牙囊細胞,絕大多數(shù)細胞呈典型的成纖維樣細胞形態(tài),抗波形絲蛋白染色陽性,抗角蛋白染色陰性,證明細胞來源于外胚間充質(zhì)。人牙囊細胞抗VEGF染色陽性,陽性部位位于胞漿。RT-PCR檢測到人牙囊細胞VEGF mRNA的表達。在人牙囊細胞培養(yǎng)上清液中檢測到VEGF蛋白。結(jié)論:用組織塊結(jié)合酶消化法在體外成功培養(yǎng)出人牙囊細胞,經(jīng)鑒定細胞來源于外胚間充質(zhì)。體外培養(yǎng)的人牙囊細胞能夠合成并分泌VEGF。 第二部分:VEGF對體外培養(yǎng)人牙囊細胞生物學特性的影響 目的:觀察VEGF對體外培養(yǎng)人牙囊細胞增殖、分化、凋亡的影響并探討可能的作用機制。方法:將生長狀態(tài)良好的第4代人牙囊細胞接種于96孔培養(yǎng)板上,分別與不同濃度的VEGF孵育3d或與100ng/mL VEGF孵育不同時間,檢測VEGF對人牙囊細胞增殖和堿性磷酸酶活性的影響。將VEGF和MAPK抑制劑不同組合加入到96孔培養(yǎng)板的細胞中,檢測MAPK抑制劑對VEGF介導(dǎo)的牙囊細胞增殖的作用。采用流式細胞儀技術(shù)觀察VEGF對人牙囊細胞凋亡的作用。結(jié)果:VEGF在10~300ng/mL范圍內(nèi)能明顯提高人牙囊細胞的增殖水平和堿性磷酸酶活性(P0.01)。VEGF處理組人牙囊細胞的增殖水平在孵育后1、3、5、7d均明顯高于對照組(P0.01),而VEGF處理組人牙囊細胞堿性磷酸酶活性在孵育后3、5、7d明顯高于對照組(P0.01)。MAPK抑制劑能削弱VEGF介導(dǎo)的人牙囊細胞增殖。VEGF處理組人牙囊細胞的凋亡率略低于對照組,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:VEGF在一定濃度范圍內(nèi)能夠促進體外培養(yǎng)人牙囊細胞的增殖,但無明顯抑制牙囊細胞凋亡的作用。MAPK信號通路是VEGF促進人牙囊細胞增殖的一條可能途徑。VEGF還能促進體外培養(yǎng)人牙囊細胞堿性磷酸酶活性的升高,提示VEGF可能是促使牙囊細胞向成骨細胞/成牙骨質(zhì)細胞表型分化的一種誘導(dǎo)因子。 第三部分:TNF-α、bFGF對體外培養(yǎng)人牙囊細胞VEGF表達的影響 目的:研究TNF-α、bFGF對體外培養(yǎng)人牙囊細胞VEGF表達的影響。方法:選取生長狀態(tài)良好的第4代人牙囊細胞,采用RT-PCR及ELISA分別檢測TNF-α(bFGF)對體外培養(yǎng)人牙囊細胞VEGF mRNA表達及上清液中VEGF含量改變的濃度和時間效應(yīng)。結(jié)果:①不同濃度TNF-α作用1h后, TNF-α處理組人牙囊細胞VEGF mRNA表達均較對照組增強(P0.05),最佳效應(yīng)濃度為25ng/mL;不同濃度TNF-α作用12h后,除1ng/mL組外,其余各組上清液中VEGF蛋白含量明顯高于對照組(P0.05)。②在時間效應(yīng)上,25ng/mL TNF-α作用1h后人牙囊細胞VEGF mRNA表達最強,然后隨時間延長其表達逐漸下降,但仍強于對照組(P0.05);細胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白含量隨時間延長逐漸增加,但TNF-α處理組VEGF蛋白含量高于對照組(P0.05)。③不同濃度bFGF作用6h后, bFGF處理組人牙囊細胞VEGF mRNA表達均較對照組增強(P0.05),最佳效應(yīng)濃度為10ng/mL;不同濃度bFGF作用12h后,bFGF處理組上清液中VEGF蛋白含量明顯高于對照組(P0.05)。④在時間效應(yīng)上,bFGF作用1、3、6、12h后人牙囊細胞VEGF mRNA表達均較對照組顯著增強(P0.01),其中bFGF作用6h后VEGF mRNA表達最強;細胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白含量隨時間延長逐漸增加,但bFGF處理組VEGF蛋白含量高于對照組(P0.01)。結(jié)論:TNF-α、bFGF能夠促進體外培養(yǎng)人牙囊細胞合成并分泌VEGF。 第四部分:PKC、cAMP/PKA信號通路在調(diào)控體外培養(yǎng)人牙囊細胞VEGF表達中的作用 目的:探討PKC、cAMP/PKA信號通路在調(diào)控體外培養(yǎng)人牙囊細胞VEGF表達中的作用。方法:選取生長狀態(tài)良好的第4代人牙囊細胞,采用Real-time PCR分別檢測PKC激動劑(PMA)、PKC非特異性抑制劑(G?6983)、PKC-α和γ特異性抑制劑(HBDDE)、PKC-β特異性抑制劑(LY333531)、cAMP/PKA激動劑(dbcAMP)和抑制劑(KT5720)對體外培養(yǎng)人牙囊細胞VEGF mRNA表達的影響。結(jié)果:PMA組和PMA+HBDDE組VEGF mRNA的表達水平明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);而PMA+G?6983組和PMA+LY333531組VEGF mRNA的表達水平與對照組之間無明顯差異(P0.05)。dbcAMP組VEGF mRNA的表達水平明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);而dbcAMP+KT5720組VEGF mRNA的表達水平與對照組之間無明顯差異(P0.05)。結(jié)論:PKC、cAMP/PKA信號通路均參與體外培養(yǎng)人牙囊細胞VEGF表達的調(diào)控,其中PKC信號通路中參與調(diào)控的亞單位是PKC-β。 第五部分:VEGF對體外培養(yǎng)人牙囊細胞OPG、RANKL表達的影響 目的:探討VEGF對體外培養(yǎng)人牙囊細胞OPG、RANKL表達的影響。方法:將生長狀態(tài)良好的第4代人牙囊細胞與25ng/mL VEGF孵育不同時間后,采用RT-PCR分別檢測OPG mRNA、RANKL mRNA表達的變化,采用ELISA檢測上清液中OPG蛋白含量變化。結(jié)果:人牙囊細胞與VEGF孵育6h后RANKL mRNA表達最強,與對照組之間的差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。其余各組RANKL mRNA表達水平較對照組略有升高,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。人牙囊細胞與VEGF孵育1h后OPG mRNA表達水平開始下降,但與對照組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。孵育3h后OPG mRNA表達顯著降低,與對照組之間的差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。以后OPG mRNA表達水平逐漸恢復(fù),與對照組之間無明顯差異(P0.05)。細胞培養(yǎng)上清液中OPG蛋白含量隨時間延長逐漸增加,但VEGF處理組OPG蛋白含量低于對照組(P0.05)。結(jié)論:VEGF能夠抑制體外培養(yǎng)人牙囊細胞OPG的表達,促進其RANKL的表達,通過RANKL-RANK-OPG軸調(diào)節(jié)破骨細胞的形成和分化,參與牙齒萌出的調(diào)控。
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第四軍醫(yī)大學博士學位論文165、189 和 206 個氨基酸殘基構(gòu)成，所形成的 VEGF 同源二聚體分別稱VEGF121（缺少外顯子 6 和 7）、VEGF145（缺少外顯子 7）、VEGF165（少外顯子 6）、VEGF189（包含 8 個外顯子）和 VEGF206（包含所有外顯及部分第 7 內(nèi)含子）[74,77]（圖 1）。

圖 2 VEGF 受體的結(jié)構(gòu)示意圖在所有 VEGF 受體中，VEGFR-1 與 VEGF 的親和力最強，，但其酪氨酸激酶活性卻非常弱，而 VEGFR-2 雖然與 VEGF 親和力低，但其激酶活性并不弱于其它酪氨酸激酶型受體（如表皮生長因子受體 EGFR）[88,89]。另外，最近研究發(fā)現(xiàn)只與 VEGF165 結(jié)合的受體 NRP-1 可以使 VEGF165 與 VEGFR-的結(jié)合力增強 10 倍以上[90]，這說明 VEGF165 與 VEGFR-2 的結(jié)合及其后的信號傳導(dǎo)在 VEGF 促進血管生成中可能起到較為關(guān)鍵的作用。研究發(fā)現(xiàn)VEGFR-2 在胚胎形成過程中對血管生成起較強的正性調(diào)控作用，而 VEGFR-則對血管形成主要起負性調(diào)節(jié)作用[91,92]。VEGFR-1 和 VEGFR-2 主要分布在血管內(nèi)皮細胞上，其他細胞如造血細胞、單核細胞、平滑肌細胞、巨核細胞、滋養(yǎng)層細胞、視網(wǎng)膜祖細胞、NIH3T3
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R78

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2 金作林,林珠,焦光海,王海雪;人牙囊細胞中表皮生長因子的表達以及流體靜壓力下的改變[J];口腔醫(yī)學研究;2005年03期

3 常秀梅,劉宏偉,金巖,劉源,賀慧霞;人牙囊細胞的體外分離、培養(yǎng)及表型鑒定[J];臨床口腔醫(yī)學雜志;2004年12期

4 金作林,林珠;人牙囊細胞的培養(yǎng)及其特性[J];口腔醫(yī)學研究;2002年04期

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本文編號：2641349