【摘要】：胰島素樣生長(zhǎng)因子-1是一類具有促有絲分裂的蛋白質(zhì)，可以促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞骨向分化。然而，外源性的胰島素樣生長(zhǎng)因子是否能促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞的增殖、骨向分化及其調(diào)控機(jī)制仍不明確。本實(shí)驗(yàn)將從下述三個(gè)部分對(duì)這一問題進(jìn)行探討。 1.人牙周膜干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及鑒定 目的：獲得純化的人牙周膜干細(xì)胞。方法：經(jīng)患者同意收集臨床上因正畸拔除的前磨牙，采用酶消化法進(jìn)行牙周膜干細(xì)胞原代培養(yǎng)。采用有限稀釋法及免疫磁珠分選法對(duì)原代培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞行進(jìn)純化。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)狀況及克隆形成情況。采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)方法對(duì)細(xì)胞增殖情況及細(xì)胞周期分布分析。通過細(xì)胞免疫化學(xué)方法對(duì)細(xì)胞來源進(jìn)行鑒定。結(jié)果：人牙周膜干細(xì)胞為成纖維細(xì)胞形態(tài)，抗VIM染色陽(yáng)性，抗CK染色陰性，，為間充質(zhì)來源；MTT法繪制生長(zhǎng)曲線計(jì)算群體倍增時(shí)間為45.74±0.91h；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布計(jì)算增殖指數(shù)為25.58%。結(jié)論：通過酶消化法、有限稀釋法及免疫磁珠法獲得純化的人牙周膜干細(xì)胞，體外培養(yǎng)呈現(xiàn)出成纖維細(xì)胞克隆生長(zhǎng)，具有較快的增殖能力，屬于間質(zhì)來源的成體干細(xì)胞。 2.胰島素樣生長(zhǎng)因子-1對(duì)人牙周膜干細(xì)胞增殖能力及骨向分化能力的影響 目的：為探討外源性胰島素樣生長(zhǎng)因子-1對(duì)人牙周膜干細(xì)胞增殖能力及骨向分化能力的影響。方法：體外研究：利用MTT法并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)確定胰島素樣生長(zhǎng)因子-1對(duì)人牙周膜干細(xì)胞作用的最佳濃度。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期及繪制生長(zhǎng)曲線檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，透射電鏡觀察細(xì)胞器的改變；檢測(cè)堿性磷酸酶活性，茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR及Westernblot檢測(cè)相關(guān)基因/蛋白表達(dá)量改變情況；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：以1×106密度收集IGF-1誘導(dǎo)7d及未經(jīng)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1誘導(dǎo)的人牙周膜干細(xì)胞與明膠海綿復(fù)合后移植到大鼠的腎被膜下，3W后取材、固定、脫礦、包埋、連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色及IHC染色檢測(cè)移植物組織形態(tài)及相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：確定IGF-1對(duì)人牙周膜干細(xì)胞的最佳作用濃度為100ng/mL。IGF-1刺激后堿性磷酸酶活性增高，茜素紅染色后CPC定量分析鈣離子含量升高。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR及Westernblot顯示在IGF-1刺激后相關(guān)基因蛋白(RUNX2/RUNX2，OSX/OSX,OCN/OCN)表達(dá)上調(diào)。體內(nèi)結(jié)果顯示：IGF-1誘導(dǎo)后的人牙周膜干細(xì)胞在腎被膜下形成的組織HE染色可見較大面積的骨樣組織；免疫組織化學(xué)染色RUNX2,OSX,OCN陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)于未經(jīng)IGF-1刺激的對(duì)照組。結(jié)論：IGF-1可促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞增殖及骨向分化能力。 3.胰島素樣生長(zhǎng)因子-1通過激活ERK/JNKMAPK信號(hào)通路促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞的骨向分化 目的：探討IGF-1在促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞骨向分化中的作用機(jī)制。方法：采用Westernblot方法檢測(cè)MAPK信號(hào)通路蛋白磷酸化水平；采用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法檢測(cè)MAPK信號(hào)通路被抑制后，IGF-1對(duì)人牙周膜干細(xì)胞RUNX2,OSXmRNA表達(dá)的影響。結(jié)果：IGF-1激活人牙周膜干細(xì)胞ERK/JNKMAPK信號(hào)通路。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR顯示：在ERK/JNKMAPK通路被抑制后，IGF-1不能上調(diào)RUNX2,OSXmRNA的表達(dá)。結(jié)論：IGF-1可能是通過激活ERK/JNKMAPK信號(hào)通路促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞的骨向分化能力。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R780.2

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本文編號(hào)：2636783