【摘要】：胰島素樣生長因子-1是一類具有促有絲分裂的蛋白質(zhì)，可以促進牙周膜成纖維細胞骨向分化。然而，外源性的胰島素樣生長因子是否能促進人牙周膜干細胞的增殖、骨向分化及其調(diào)控機制仍不明確。本實驗將從下述三個部分對這一問題進行探討。 1.人牙周膜干細胞體外分離培養(yǎng)及鑒定 目的：獲得純化的人牙周膜干細胞。方法：經(jīng)患者同意收集臨床上因正畸拔除的前磨牙，采用酶消化法進行牙周膜干細胞原代培養(yǎng)。采用有限稀釋法及免疫磁珠分選法對原代培養(yǎng)的牙周膜干細胞行進純化。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、生長狀況及克隆形成情況。采用MTT法、流式細胞術方法對細胞增殖情況及細胞周期分布分析。通過細胞免疫化學方法對細胞來源進行鑒定。結果：人牙周膜干細胞為成纖維細胞形態(tài)，抗VIM染色陽性，抗CK染色陰性，，為間充質(zhì)來源；MTT法繪制生長曲線計算群體倍增時間為45.74±0.91h；流式細胞術分析細胞周期分布計算增殖指數(shù)為25.58%。結論：通過酶消化法、有限稀釋法及免疫磁珠法獲得純化的人牙周膜干細胞，體外培養(yǎng)呈現(xiàn)出成纖維細胞克隆生長，具有較快的增殖能力，屬于間質(zhì)來源的成體干細胞。 2.胰島素樣生長因子-1對人牙周膜干細胞增殖能力及骨向分化能力的影響 目的：為探討外源性胰島素樣生長因子-1對人牙周膜干細胞增殖能力及骨向分化能力的影響。方法：體外研究：利用MTT法并結合相關文獻確定胰島素樣生長因子-1對人牙周膜干細胞作用的最佳濃度。流式細胞術分析細胞周期及繪制生長曲線檢測細胞增殖能力，透射電鏡觀察細胞器的改變；檢測堿性磷酸酶活性，茜素紅鈣化結節(jié)染色，實時熒光定量RT-PCR及Westernblot檢測相關基因/蛋白表達量改變情況；體內(nèi)實驗：以1×106密度收集IGF-1誘導7d及未經(jīng)胰島素樣生長因子-1誘導的人牙周膜干細胞與明膠海綿復合后移植到大鼠的腎被膜下，3W后取材、固定、脫礦、包埋、連續(xù)切片，進行HE染色及IHC染色檢測移植物組織形態(tài)及相關蛋白表達情況。結果：確定IGF-1對人牙周膜干細胞的最佳作用濃度為100ng/mL。IGF-1刺激后堿性磷酸酶活性增高，茜素紅染色后CPC定量分析鈣離子含量升高。實時熒光定量RT-PCR及Westernblot顯示在IGF-1刺激后相關基因蛋白(RUNX2/RUNX2，OSX/OSX,OCN/OCN)表達上調(diào)。體內(nèi)結果顯示：IGF-1誘導后的人牙周膜干細胞在腎被膜下形成的組織HE染色可見較大面積的骨樣組織；免疫組織化學染色RUNX2,OSX,OCN陽性表達強于未經(jīng)IGF-1刺激的對照組。結論：IGF-1可促進人牙周膜干細胞增殖及骨向分化能力。 3.胰島素樣生長因子-1通過激活ERK/JNKMAPK信號通路促進人牙周膜干細胞的骨向分化 目的：探討IGF-1在促進人牙周膜干細胞骨向分化中的作用機制。方法：采用Westernblot方法檢測MAPK信號通路蛋白磷酸化水平；采用熒光實時定量RT-PCR的方法檢測MAPK信號通路被抑制后，IGF-1對人牙周膜干細胞RUNX2,OSXmRNA表達的影響。結果：IGF-1激活人牙周膜干細胞ERK/JNKMAPK信號通路。實時熒光定量RT-PCR顯示：在ERK/JNKMAPK通路被抑制后，IGF-1不能上調(diào)RUNX2,OSXmRNA的表達。結論：IGF-1可能是通過激活ERK/JNKMAPK信號通路促進人牙周膜干細胞的骨向分化能力。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R780.2

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