【摘要】：目的： 齲病是牙體硬組織的細(xì)菌感染性疾病，是人類最常見的疾病之一，尤其多發(fā)于兒童。細(xì)菌學(xué)研究和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)變形鏈球菌是最主要的致齲菌。其致齲作用的發(fā)揮與其耐酸性息息相關(guān)，變形鏈球菌耐酸相關(guān)基因luxS編碼的核糖基高半胱氨酸酶，通過(guò)一系列酶促反應(yīng)合成自體誘導(dǎo)物信號(hào)分子AI-2，AI-2作為種屬間的通用信號(hào)分子，參與群體感應(yīng)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)菌群密度，調(diào)控細(xì)菌的生物功能進(jìn)而影響生物膜的形成，增強(qiáng)菌群的耐酸能力和抗藥能力，可見核糖基高半胱氨酸酶在變形鏈球菌的耐酸作用中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。迄今為止，變形鏈球菌的耐酸機(jī)制仍不清晰，我們希望通過(guò)對(duì)變形鏈球菌耐酸相關(guān)基因luxS編碼的核糖基高半胱氨酸酶的晶體結(jié)構(gòu)研究，更深刻的揭示變形鏈球菌的耐酸機(jī)制，也為齲病的防治提供新的思路和理論指導(dǎo)。 方法： 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定根據(jù)GenBank中l(wèi)uxS基因序列，設(shè)計(jì)特異性PCR引物，擴(kuò)增luxS基因序列，將其克隆至pGEX-6p-1載體中，構(gòu)建GST標(biāo)簽融合的重組質(zhì)粒。 目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）中， IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE和質(zhì)譜分析表達(dá)的目標(biāo)蛋白。利用GST親和層析、陰離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析純化目標(biāo)蛋白。 目標(biāo)蛋白的結(jié)晶與結(jié)構(gòu)解析使用Hampton Research公司的晶體生長(zhǎng)試劑盒對(duì)純度達(dá)95%以上的目標(biāo)蛋白進(jìn)行晶體生長(zhǎng)條件篩選，對(duì)初篩的生長(zhǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期得到適于X射線衍射的單晶，，通過(guò)同步輻射加速器收集晶體衍射數(shù)據(jù)，借助于CCP4等一系列蛋白結(jié)構(gòu)解析軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。 結(jié)果： 核糖基高半胱氨酸酶在大腸桿菌中高效、可溶性表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE及質(zhì)譜鑒定分析，證實(shí)所表達(dá)的蛋白為核糖基高半胱氨酸酶。 對(duì)核糖基高半胱氨酸酶的表達(dá)及純化條件進(jìn)行優(yōu)化，確立了目標(biāo)蛋白的純化工藝，經(jīng)SDS-PAGE分析，最終得到純度高達(dá)95%以上的目標(biāo)蛋白。 使用Hampton Research公司的晶體生長(zhǎng)試劑盒對(duì)晶體生長(zhǎng)條件進(jìn)行篩選，得到目標(biāo)蛋白的晶體生長(zhǎng)條件，進(jìn)一步對(duì)晶體生長(zhǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到適于X射線衍射數(shù)據(jù)收集的單晶。 在北京同步輻射光源收集核糖基高半胱氨酸酶晶體的X射線衍射數(shù)據(jù)，晶體衍射分辨率達(dá)到2.4A，屬于C2221空間群。 結(jié)論： 成功的在大腸桿菌中高效表達(dá)了變形鏈球菌耐酸相關(guān)基因luxS編碼的核糖基高半胱氨酸酶蛋白，建立完善的蛋白純化工藝，并成功得到核糖基高半胱氨酸酶的晶體，分析晶體X射線衍射數(shù)據(jù)。
【圖文】：

菌株 coli XL-1 blue 首都醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室 coli BL21(DE3) 首都醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室reptococcus mutans UA159 首都醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)粒載體EX-6p-1 用于構(gòu)建原核表達(dá)載體（Novagen）（圖 1）。pGEX 載體系統(tǒng)是隆表達(dá)重組蛋白的功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)之一。在 pGEX 載體上構(gòu)建有重組Schistosoma japonicum）GST 蛋白（分子量 26kd）的結(jié)構(gòu)，GST 天然存物體內(nèi)，帶有全長(zhǎng) GST 標(biāo)簽的蛋白被證實(shí)具有 GST 酶的活性，能夠二EX 載體上多克隆位點(diǎn)上游包含有蛋白酶的識(shí)別序列（圖 2），可根據(jù)需的蛋白酶切除[18]。

圖 2 pGEX-6p-1 多克隆位點(diǎn)及酶切位點(diǎn)ig.2 Multiple cloning site and protease cleavage site map of pGEX-6p-1.3 工具酶及 DNA、蛋白質(zhì)分子量 MarkerBamH I 限制性內(nèi)切酶 New England BiolabsXhol I 限制性內(nèi)切酶 New England BiolabsT4 DNA 連接酶 New England Biolabspfu Polymerase 首都醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供DNA Marker 首都醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供蛋白質(zhì)分子量 Marker TaKaRa 公司.4 試劑盒細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒 北京天為時(shí)代公司DNA 凝膠回收試劑盒 Omega 公司
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R781.1

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1 高巽坤;堿性和酸性合成多肽對(duì)口腔變形鏈球菌及血型鏈球菌粘附烴磷灰石的影響[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊(cè);1987年02期

2 邊專,杜民權(quán);變形鏈球菌與心臟交叉反應(yīng)研究概況[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊(cè);1996年06期

3 文立亞,閆巖,尹文,吳興安,姜紹淳,馬文煜;抗變形鏈球菌SAⅠ/Ⅱ單抗重鏈可變區(qū)基因克隆及序列分析[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;1999年01期

4 莊Y

本文編號(hào)：2636380