【摘要】：牙骨質(zhì)是貼附在牙根表面的薄層礦化組織,是牙周組織的重要組成部分,也是正畸治療牙齒移動的基礎。在牙根發(fā)育完成后牙骨質(zhì)通常不再發(fā)生生理性改建,缺乏與骨組織類似的重塑能力。在正畸治療導致牙骨質(zhì)吸收后,牙骨質(zhì)的修復依靠成牙骨質(zhì)細胞完成,伴隨成牙骨質(zhì)細胞增殖、分化及礦化,逐漸形成修復性牙骨質(zhì)。因此研究如何提高成牙骨質(zhì)細胞的功能對于牙骨質(zhì)修復十分重要,也為防治正畸性牙根吸收和牙周組織修復提供理論基礎。IL1β是感染早期最常見的細胞因子之一,可調(diào)節(jié)免疫反應介導的炎癥作用,在正畸患者和牙周炎患者的牙周組織中高表達,有誘導炎癥損傷、促進骨吸收和抑制成骨細胞分化的作用。但是,IL1β在牙骨質(zhì)代謝中的作用,尤其是對成牙骨質(zhì)細胞的作用機制研究較少,我們進行以下實驗旨在探討IL1β對成牙骨質(zhì)細胞分化的作用及機制,為炎癥性牙骨質(zhì)喪失疾病的防治提供理論基礎。1.IL1β對成牙骨質(zhì)細胞的作用目的:探討IL1β對成牙骨質(zhì)細胞增殖、分化及礦化作用。方法:培養(yǎng)成牙骨質(zhì)細胞系OCCM-30,使用IL1β重組蛋白(10 ng/mL)處理成牙骨質(zhì)細胞并對其進行成牙骨質(zhì)礦化誘導。MTT法檢測IL1β對成牙骨質(zhì)細胞增殖的影響;流式細胞術(shù)觀察IL1β對成牙骨質(zhì)細胞凋亡的影響;real-time PCR及Western blot法測定成牙骨質(zhì)分化相關(guān)基因runx2和osterix的表達水平;微板法定量和染色法定性檢測成牙骨質(zhì)細胞的堿性磷酸酶活性;茜素紅染色及相對定量分析礦化結(jié)節(jié)形成量。結(jié)果:IL1β對成牙骨質(zhì)細胞的增殖及凋亡無影響;下調(diào)runx2和osterix的表達水平,降低堿性磷酸酶活性及礦化結(jié)節(jié)形成能力。結(jié)論:IL1β對成牙骨質(zhì)細胞的分化有抑制作用。2.MiR-325-3p在IL1β抑制的成牙骨質(zhì)細胞分化中的調(diào)控作用目的:在microRNA參與的轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控水平上,探討IL1β抑制成牙骨質(zhì)細胞分化的作用機制。方法:利用生物信息學分析技術(shù)及real-time PCR實驗篩選出miR-325-3p,應用雙熒光素酶及免疫熒光實驗驗證其靶基因。在加入IL1β刺激的同時瞬時轉(zhuǎn)染miR-325-3p,檢測成牙骨質(zhì)細胞分化相關(guān)基因runx2和osterix的表達水平。同時,建立小鼠異位成骨模型,對移植物進行micro-CT、堿性磷酸酶活性及鈣離子含量檢測。結(jié)果:IL1β上調(diào)miR-325-3p的表達,且miR-325-3p直接靶向runx2。轉(zhuǎn)染miR-325-3p mimic可下調(diào)成牙骨質(zhì)細胞runx2和osterix的表達水平,在異位成骨實驗中可顯著降低新形成的牙骨質(zhì)樣組織的骨密度、骨體積分數(shù)、堿性磷酸酶活性及鈣離子含量;而轉(zhuǎn)染miR-325-3p inhibitor得到的結(jié)果與mimic完全相反。在加入IL1β刺激的炎癥狀態(tài)下,成牙骨質(zhì)分化相關(guān)基因表達及體內(nèi)成牙骨質(zhì)能力顯著降低;并且在轉(zhuǎn)染miR-325-3p inhibitor后IL1β的作用被減弱。結(jié)論:IL1β通過上調(diào)miR-325-3p的表達,直接作用于靶基因runx2,進而抑制成牙骨質(zhì)細胞分化;轉(zhuǎn)染miR-325-3p inhibitor可減弱IL1β對成牙骨質(zhì)細胞分化的抑制作用。3.轉(zhuǎn)錄組測序分析IL1β對牙骨質(zhì)細胞分化的作用機制目的:在轉(zhuǎn)錄水平上更全面地探討IL1β抑制成牙骨質(zhì)細胞分化的作用機制。方法:對IL1β處理與非處理組的成牙骨質(zhì)細胞生物樣本進行轉(zhuǎn)錄組二代測序分析。首先,收集細胞樣本,提取樣本RNA,構(gòu)建RNA-seq文庫;其次,對文庫測序并對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量檢測、數(shù)據(jù)過濾及統(tǒng)計;然后,對測序數(shù)據(jù)進行差異表達分析、GO和KEGG生物信息學分析。結(jié)果:成牙骨質(zhì)細胞生物樣本文庫構(gòu)建成功;測序樣本達到高質(zhì)量讀段控制標準;共得到112個顯著差異基因,包括85個上調(diào)基因和27個下調(diào)基因;GO富集分析揭示了整個作用過程中有1735個GO功能條目被顯著富集(p0.05),在免疫應答反應、對細胞外刺激反應等條目中顯示富集較高;KEGG富集分析顯示共有12個通路被顯著富集(p0.05),其中TNF信號通路、細胞因子與受體相互作用途徑、趨化因子信號通路、PI3K-Akt信號通路、Toll樣受體信號通路、JakSTAT信號通路為最主要的富集通路。結(jié)論:IL1β可刺激成牙骨質(zhì)細胞產(chǎn)生免疫應答等多種生物學反應,可能通過TNF、PI3K-Akt等信號通路途徑發(fā)揮作用,為探討IL1β抑制成牙骨質(zhì)細胞分化的作用機制提供有價值的新線索。4.Lcn2對成牙骨質(zhì)細胞分化的作用目的:Lcn2作為測序得到的差異最顯著且表達豐度較高的“關(guān)鍵”基因,其在成牙骨質(zhì)代謝調(diào)控中的作用亟待研究,本部分實驗旨在探討lcn2在調(diào)節(jié)成牙骨質(zhì)細胞分化中的作用。方法:構(gòu)建lcn2過表達質(zhì)粒載體和沉默lcn2的siRNA,使用瞬時轉(zhuǎn)染法建立成牙骨質(zhì)細胞過表達和敲減體系;流式細胞技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率;real-time PCR和Western blot法檢測lcn2過表達和敲減的效果,以及對分化相關(guān)基因runx2、osterix等基因和蛋白表達情況的影響。結(jié)果:成功構(gòu)建lcn2過表達質(zhì)粒及沉默siRNA,瞬時轉(zhuǎn)染效率較高。在mRNA水平上過表達lcn2顯著高于對照組約25倍,敲減后約為對照組的一半;在蛋白水平上過表達lcn2表達增加約一倍,敲減后約為對照組的一半。Lcn2對成牙骨質(zhì)細胞分化相關(guān)基因runx2、osterix、alp和ocn mRNA表達起負調(diào)控作用,對opn mRNA表達起正調(diào)控作用,對runx2和osterix的蛋白表達具有負調(diào)控作用。結(jié)論:Lcn2對成牙骨質(zhì)細胞的分化有抑制作用。綜上所述,IL1β對成牙骨質(zhì)細胞分化有抑制作用,其機制可能是在microRNA參與的轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控層面,通過激活miR-325-3p進而抑制下游轉(zhuǎn)錄因子runx2的表達,完成抑制成牙骨質(zhì)細胞分化的過程;也可能是在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,測序篩選出的關(guān)鍵蛋白lcn2的表達被激活,進而抑制成牙骨質(zhì)細胞的分化;轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果為以后的研究提供線索,有待于進一步挖掘。
【圖文】：

圖 1.1 巨噬細胞對牙根吸收過程影響示意圖（引自 A. Iglesias-Linares 等[15]）牙周膜與類牙骨質(zhì)層作為牙周的保護組織，參與了抵抗牙根吸收的過程，主要表現(xiàn)在以下兩個方面：（1）類牙骨質(zhì)層位于牙骨質(zhì)的外層，是一層未完全礦化的薄層組織，破牙骨質(zhì)細胞對牙骨質(zhì)產(chǎn)生骨吸收作用時須先穿過類牙骨質(zhì)層，相比于牙骨質(zhì)層類牙骨質(zhì)層富含有機成分，具有更強的物理抵抗作用，為保護牙根吸收提供第一道屏障[20]。（2）牙周膜與牙骨質(zhì)間的細胞層，包含成牙骨質(zhì)細胞、成骨細胞、成纖維細胞等，內(nèi)環(huán)境因素改變激活其增殖、分化和礦化的能力，形成修復性牙骨質(zhì)，對牙根吸收形成的牙骨質(zhì)陷窩進行修復[21]。由此可知，正畸治療常引起牙骨質(zhì)破壞，導致正畸炎性牙根吸收，誘導牙骨質(zhì)再生是抵抗和修復牙根吸收的主要方法。1.2 牙骨質(zhì)再生是牙根外吸收修復的關(guān)鍵牙骨質(zhì)是牙周組織的重要組成部分，位于牙周膜與牙根之間，是貼附于牙根

在顯微鏡下觀察結(jié)果如圖2.1 所示，細胞傳代后約 4 h 即可貼壁，由漂浮的圓形細胞變成扁平貼壁的多角型細胞，細胞核位于胞漿中央，多為單核，，高倍鏡下可見核仁。當細胞密度較低時，細胞體積相對較大胞漿多，可見兩個以上較長突起，相鄰細胞的突起可連接在一起；當細胞密度較大時，細胞間基本無空隙，細胞體積隨胞漿減少而變小，細胞壓縮為長梭形，可由單層生長成為復層細胞。xs
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R78

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本文編號：2632335