【摘要】：牙骨質(zhì)是貼附在牙根表面的薄層礦化組織,是牙周組織的重要組成部分,也是正畸治療牙齒移動(dòng)的基礎(chǔ)。在牙根發(fā)育完成后牙骨質(zhì)通常不再發(fā)生生理性改建,缺乏與骨組織類似的重塑能力。在正畸治療導(dǎo)致牙骨質(zhì)吸收后,牙骨質(zhì)的修復(fù)依靠成牙骨質(zhì)細(xì)胞完成,伴隨成牙骨質(zhì)細(xì)胞增殖、分化及礦化,逐漸形成修復(fù)性牙骨質(zhì)。因此研究如何提高成牙骨質(zhì)細(xì)胞的功能對(duì)于牙骨質(zhì)修復(fù)十分重要,也為防治正畸性牙根吸收和牙周組織修復(fù)提供理論基礎(chǔ)。IL1β是感染早期最常見的細(xì)胞因子之一,可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)介導(dǎo)的炎癥作用,在正畸患者和牙周炎患者的牙周組織中高表達(dá),有誘導(dǎo)炎癥損傷、促進(jìn)骨吸收和抑制成骨細(xì)胞分化的作用。但是,IL1β在牙骨質(zhì)代謝中的作用,尤其是對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的作用機(jī)制研究較少,我們進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)旨在探討IL1β對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的作用及機(jī)制,為炎癥性牙骨質(zhì)喪失疾病的防治提供理論基礎(chǔ)。1.IL1β對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的作用目的:探討IL1β對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞增殖、分化及礦化作用。方法:培養(yǎng)成牙骨質(zhì)細(xì)胞系OCCM-30,使用IL1β重組蛋白(10 ng/mL)處理成牙骨質(zhì)細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行成牙骨質(zhì)礦化誘導(dǎo)。MTT法檢測(cè)IL1β對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)觀察IL1β對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響;real-time PCR及Western blot法測(cè)定成牙骨質(zhì)分化相關(guān)基因runx2和osterix的表達(dá)水平;微板法定量和染色法定性檢測(cè)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的堿性磷酸酶活性;茜素紅染色及相對(duì)定量分析礦化結(jié)節(jié)形成量。結(jié)果:IL1β對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的增殖及凋亡無(wú)影響;下調(diào)runx2和osterix的表達(dá)水平,降低堿性磷酸酶活性及礦化結(jié)節(jié)形成能力。結(jié)論:IL1β對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的分化有抑制作用。2.MiR-325-3p在IL1β抑制的成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化中的調(diào)控作用目的:在microRNA參與的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控水平上,探討IL1β抑制成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的作用機(jī)制。方法:利用生物信息學(xué)分析技術(shù)及real-time PCR實(shí)驗(yàn)篩選出miR-325-3p,應(yīng)用雙熒光素酶及免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其靶基因。在加入IL1β刺激的同時(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-325-3p,檢測(cè)成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化相關(guān)基因runx2和osterix的表達(dá)水平。同時(shí),建立小鼠異位成骨模型,對(duì)移植物進(jìn)行micro-CT、堿性磷酸酶活性及鈣離子含量檢測(cè)。結(jié)果:IL1β上調(diào)miR-325-3p的表達(dá),且miR-325-3p直接靶向runx2。轉(zhuǎn)染miR-325-3p mimic可下調(diào)成牙骨質(zhì)細(xì)胞runx2和osterix的表達(dá)水平,在異位成骨實(shí)驗(yàn)中可顯著降低新形成的牙骨質(zhì)樣組織的骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、堿性磷酸酶活性及鈣離子含量;而轉(zhuǎn)染miR-325-3p inhibitor得到的結(jié)果與mimic完全相反。在加入IL1β刺激的炎癥狀態(tài)下,成牙骨質(zhì)分化相關(guān)基因表達(dá)及體內(nèi)成牙骨質(zhì)能力顯著降低;并且在轉(zhuǎn)染miR-325-3p inhibitor后IL1β的作用被減弱。結(jié)論:IL1β通過(guò)上調(diào)miR-325-3p的表達(dá),直接作用于靶基因runx2,進(jìn)而抑制成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化;轉(zhuǎn)染miR-325-3p inhibitor可減弱IL1β對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的抑制作用。3.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析IL1β對(duì)牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的作用機(jī)制目的:在轉(zhuǎn)錄水平上更全面地探討IL1β抑制成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的作用機(jī)制。方法:對(duì)IL1β處理與非處理組的成牙骨質(zhì)細(xì)胞生物樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組二代測(cè)序分析。首先,收集細(xì)胞樣本,提取樣本RNA,構(gòu)建RNA-seq文庫(kù);其次,對(duì)文庫(kù)測(cè)序并對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)、數(shù)據(jù)過(guò)濾及統(tǒng)計(jì);然后,對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析、GO和KEGG生物信息學(xué)分析。結(jié)果:成牙骨質(zhì)細(xì)胞生物樣本文庫(kù)構(gòu)建成功;測(cè)序樣本達(dá)到高質(zhì)量讀段控制標(biāo)準(zhǔn);共得到112個(gè)顯著差異基因,包括85個(gè)上調(diào)基因和27個(gè)下調(diào)基因;GO富集分析揭示了整個(gè)作用過(guò)程中有1735個(gè)GO功能條目被顯著富集(p0.05),在免疫應(yīng)答反應(yīng)、對(duì)細(xì)胞外刺激反應(yīng)等條目中顯示富集較高;KEGG富集分析顯示共有12個(gè)通路被顯著富集(p0.05),其中TNF信號(hào)通路、細(xì)胞因子與受體相互作用途徑、趨化因子信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、JakSTAT信號(hào)通路為最主要的富集通路。結(jié)論:IL1β可刺激成牙骨質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答等多種生物學(xué)反應(yīng),可能通過(guò)TNF、PI3K-Akt等信號(hào)通路途徑發(fā)揮作用,為探討IL1β抑制成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的作用機(jī)制提供有價(jià)值的新線索。4.Lcn2對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的作用目的:Lcn2作為測(cè)序得到的差異最顯著且表達(dá)豐度較高的“關(guān)鍵”基因,其在成牙骨質(zhì)代謝調(diào)控中的作用亟待研究,本部分實(shí)驗(yàn)旨在探討lcn2在調(diào)節(jié)成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化中的作用。方法:構(gòu)建lcn2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體和沉默lcn2的siRNA,使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法建立成牙骨質(zhì)細(xì)胞過(guò)表達(dá)和敲減體系;流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率;real-time PCR和Western blot法檢測(cè)lcn2過(guò)表達(dá)和敲減的效果,以及對(duì)分化相關(guān)基因runx2、osterix等基因和蛋白表達(dá)情況的影響。結(jié)果:成功構(gòu)建lcn2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及沉默siRNA,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率較高。在mRNA水平上過(guò)表達(dá)lcn2顯著高于對(duì)照組約25倍,敲減后約為對(duì)照組的一半;在蛋白水平上過(guò)表達(dá)lcn2表達(dá)增加約一倍,敲減后約為對(duì)照組的一半。Lcn2對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化相關(guān)基因runx2、osterix、alp和ocn mRNA表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用,對(duì)opn mRNA表達(dá)起正調(diào)控作用,對(duì)runx2和osterix的蛋白表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用。結(jié)論:Lcn2對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的分化有抑制作用。綜上所述,IL1β對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化有抑制作用,其機(jī)制可能是在microRNA參與的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控層面,通過(guò)激活miR-325-3p進(jìn)而抑制下游轉(zhuǎn)錄因子runx2的表達(dá),完成抑制成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的過(guò)程;也可能是在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,測(cè)序篩選出的關(guān)鍵蛋白lcn2的表達(dá)被激活,進(jìn)而抑制成牙骨質(zhì)細(xì)胞的分化;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果為以后的研究提供線索,有待于進(jìn)一步挖掘。
【圖文】：

圖 1.1 巨噬細(xì)胞對(duì)牙根吸收過(guò)程影響示意圖（引自 A. Iglesias-Linares 等[15]）牙周膜與類牙骨質(zhì)層作為牙周的保護(hù)組織，參與了抵抗牙根吸收的過(guò)程，主要表現(xiàn)在以下兩個(gè)方面：（1）類牙骨質(zhì)層位于牙骨質(zhì)的外層，是一層未完全礦化的薄層組織，破牙骨質(zhì)細(xì)胞對(duì)牙骨質(zhì)產(chǎn)生骨吸收作用時(shí)須先穿過(guò)類牙骨質(zhì)層，相比于牙骨質(zhì)層類牙骨質(zhì)層富含有機(jī)成分，具有更強(qiáng)的物理抵抗作用，為保護(hù)牙根吸收提供第一道屏障[20]。（2）牙周膜與牙骨質(zhì)間的細(xì)胞層，包含成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，內(nèi)環(huán)境因素改變激活其增殖、分化和礦化的能力，形成修復(fù)性牙骨質(zhì)，對(duì)牙根吸收形成的牙骨質(zhì)陷窩進(jìn)行修復(fù)[21]。由此可知，正畸治療常引起牙骨質(zhì)破壞，導(dǎo)致正畸炎性牙根吸收，誘導(dǎo)牙骨質(zhì)再生是抵抗和修復(fù)牙根吸收的主要方法。1.2 牙骨質(zhì)再生是牙根外吸收修復(fù)的關(guān)鍵牙骨質(zhì)是牙周組織的重要組成部分，位于牙周膜與牙根之間，是貼附于牙根

在顯微鏡下觀察結(jié)果如圖2.1 所示，細(xì)胞傳代后約 4 h 即可貼壁，由漂浮的圓形細(xì)胞變成扁平貼壁的多角型細(xì)胞，細(xì)胞核位于胞漿中央，多為單核，，高倍鏡下可見核仁。當(dāng)細(xì)胞密度較低時(shí)，細(xì)胞體積相對(duì)較大胞漿多，可見兩個(gè)以上較長(zhǎng)突起，相鄰細(xì)胞的突起可連接在一起；當(dāng)細(xì)胞密度較大時(shí)，細(xì)胞間基本無(wú)空隙，細(xì)胞體積隨胞漿減少而變小，細(xì)胞壓縮為長(zhǎng)梭形，可由單層生長(zhǎng)成為復(fù)層細(xì)胞。xs
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R78

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本文編號(hào)：2632335