【摘要】： 慢性牙周炎是牙周組織的慢性感染性疾病,其特點是牙周組織破壞,牙周袋形成、牙槽骨吸收,最終導致牙齒喪失。大量證據(jù)表明牙菌斑生物膜中的革蘭氏陰性菌如牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌等是引起牙周炎的始動因子。這些牙周致病菌在齦下環(huán)境中定植、繁殖,產(chǎn)生內毒素、蛋白酶等毒性物質直接破壞牙周組織;同時還可引發(fā)一系列的宿主免疫反應,產(chǎn)生大量炎性介質,間接導致牙周結締組織破壞、牙槽骨吸收。 中間普氏菌是革蘭氏陰性產(chǎn)黑色素專性厭養(yǎng)桿菌,該菌與急性壞死性潰瘍性牙齦炎、慢性牙周炎、牙周膿腫以及妊娠性牙齦炎的發(fā)病密切相關。此外,中間普氏菌還是壞疽性口炎以及肺部感染的重要致病菌,其主要致病因子包括脂多糖、凝集素、纖毛、囊泡、蛋白水解酶等。 鐵是微生物生存和繁殖所必不可少的一種營養(yǎng)元素,鐵參與多種生物過程:如光合作用、呼吸作用、氧的轉運、基因調控以及DNA生物合成等。在宿主內,由于鐵被包含于血黃素、血紅素結合蛋白、以及含血紅素的蛋白(血紅蛋白和肌紅蛋白)細胞內,或被轉鐵蛋白和乳鐵蛋白結合;此外,游離的血紅素又迅速被血液結合素和白蛋白結合,使得游離鐵濃度極低,約為10-18μM,遠低于細菌生長繁殖所需要的0.05-0.5μM。因此,細菌能否從鐵受限的環(huán)境中攝取足夠的鐵以維持其生長繁殖是其重要的毒力因子。 鐵是中間普氏菌的必需營養(yǎng)素,但由于該菌不能合成血紅素,因此必須從宿主內攝取鐵以維持其生長。迄今為止,對該菌的鐵攝取機制以及鐵對其病原性影響的研究甚少。有研究發(fā)現(xiàn),牙周炎部位齦溝液內的鐵含量明顯高于正常或齦炎部位齦溝液中的鐵含量,有學者認為齦溝液內主要的鐵源可能是紅細胞溶解所釋放的血紅蛋白(hemoglobin, Hb)。中間普氏菌釋放大量的凝血及溶血因子,可使紅細胞凝集、溶解、Hb釋放。近期有研究報道Hb作為唯一的鐵源可以促進該菌的增殖,但對于該菌從Hb攝取鐵的機制尚無研究報道。因此本研究將就中間普氏菌利用Hb鐵的可能機制進行探討。 細菌在體內的生長繁殖是其致病的首要條件,但細菌所引發(fā)的一系列宿主反應是導致組織破壞的主要因素。牙周炎時,宿主細胞所產(chǎn)生的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)和其他蛋白酶在牙周組織的破壞中起重要作用。MMP是一組鋅和鈣依賴性蛋白酶,可降解細胞外基質(extracellular matrix, ECM)和基底膜成分。MMP廣泛參與各種生理功能,如形態(tài)發(fā)生、組織改建、創(chuàng)傷愈合、宿主防御和免疫調控等。在病理性疾病如腫瘤、類風濕性關節(jié)炎和慢性牙周炎的發(fā)病中也起重要作用。大量研究表明,與牙周健康部位相比,牙周炎部位的齦溝液以及牙周組織中多種MMP水平明顯升高,提示MMP與牙周炎密切相關。 目前關于牙周膜成纖維細胞的研究相對較少。牙周膜成纖維細胞不僅在牙周膜的形成和維持中起重要作用,也在相鄰組織牙槽骨和牙骨質的修復、重建和再生中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)中間普氏菌可誘導人牙齦上皮細胞和牙周膜細胞表達炎性細胞因子,但關于中間普氏菌對MMP表達調控作用的研究甚少,迄今尚無中間普氏菌對牙周組織細胞MMP調控作用的研究報道,因此本研究將就中間普氏菌對人牙周膜細胞(human periodontalligament cells, hPDLc)分泌MMP的作用進行探討,同時探討絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)信號系統(tǒng)在中間普氏菌誘導的MMP表達中的調控作用,以期揭示中間普氏菌在牙周炎發(fā)生中的致病機制。本研究的主要結果如下: 1.中間普氏菌對Hb的利用及其鐵攝取機制 1.1利用細菌培養(yǎng)方法,證實中間普氏菌可有效利用Hb作為其鐵源。斑點印跡結果顯示,中間普氏菌細胞可與Hb結合,兩者的結合受pH影響,在弱酸性環(huán)境中的結合強度高于弱堿性環(huán)境。pH5.0時,中間普氏菌與Hb的結合能力最強。 1.2利用batch親和層析和SDS-PAGE方法鑒定出與Hb結合的中間普氏菌外膜蛋白。通過綜合運用陰離子層析、Hb凝膠親和層析和羥基磷灰石層析等蛋白質純化技術,純化出與Hb結合的60kDa外膜蛋白。 1.3 60 kDa血紅蛋白結合蛋白(hemoglobin-binding protein, HBP)與Hb的結合受pH影響, pH5.0時,HBP與Hb的結合能力最強。表面等離子共振技術對HBP和Hb相互作用的實時監(jiān)測結果表明,兩者之間的的解離系數(shù)為1.48×10-8 M,提示HBP特異性與Hb結合。 1.4抑制性研究結果表明珠蛋白可顯著抑制HBP與Hb的結合,而血紅素、過氧化氫酶以及細胞色素C對兩者的結合沒有影響,提示Hb的珠蛋白結構域而非血紅素結構域參與了HBP與Hb的結合。 1.5由于HBP的氨基端被封閉,未能夠測出HBP氨基端的氨基酸序列。利用凝膠內消化和逆相HPLC技術將HBP分離為肽片段,測定了數(shù)個肽片段的氨基酸序列。將所得到的氨基酸序列進行檢索,未發(fā)現(xiàn)這些序列與已知的HBP具有同源性,提示中間普氏菌HBP可能為新發(fā)現(xiàn)的一種HBP。 1.6鐵的限制對HBP的表達無明顯影響,提示HBP為組成性表達的蛋白;鐵限制對中間普氏菌與Hb的結合能力也無明顯影響。 1.7利用SDS-PAGE技術檢測中間普氏菌對Hb的降解并利用掃描密度儀對降解作用進行定量分析,發(fā)現(xiàn)中間普氏菌對Hb的降解具有時間依賴效應且該降解作用受pH影響,pH5.0時降解作用最強。抑制性研究結果發(fā)現(xiàn)參與Hb降解的可能是一種半胱氨酸蛋白酶。鐵的限制對中間普氏菌的Hb降解作用沒有影響,提示該半胱氨酸蛋白酶為組成性表達。 2.中間普氏菌對hPDLc MMP表達的調控作用 2.1 RT-PCR結果顯示,hPDLc組成性表達MMP-1、-2、-3、-14、TIMP-1和TIMP-2。中間普氏菌培養(yǎng)上清刺激hPDLc 6 h后,可誘導MMP-9、上調MMP-1和TIMP-1、下調TIMP-2 mRNA的表達,對其他MMP mRNA表達無影響。 2.2明膠酶譜結果顯示,中間普氏菌培養(yǎng)上清可濃度依賴性地誘導hPDLc分泌MMP-9,該誘導作用具有時間依賴效應;但對MMP-2的分泌無調控作用。 2.3利用ELISA技術檢測了其他MMP的分泌,發(fā)現(xiàn)中間普氏菌培養(yǎng)上清可濃度依賴性地增強MMP-1和TIMP-1的分泌、降低TIMP-2的分泌,該作用具有時間效應。對MMP-3的分泌無影響。 2.4 MAPK信號通路在在中間普氏菌誘導的MMP分泌中起不同調控作用:ERK、JNK和p38抑制劑對中間普氏菌誘導的MMP-9分泌無任何調控作用;ERK、JNK和p38抑制劑顯著抑制中間普氏菌對MMP-1的促分泌作用;ERK和JNK抑制劑顯著抑制中間普氏菌對TIMP-1的促分泌作用,但p38抑制劑對中間普氏菌的促TIMP分泌作用無抑制效果;JNK和p38抑制劑逆轉了中間普氏菌對TIMP-2的抑制作用;所有MAPK抑制劑均對MMP-3的分泌無明顯影響。 結論 中間普氏菌可有效利用Hb作為其鐵源,該菌從Hb攝取鐵的可能機制是:首先細胞外膜的60kDa HBP與Hb特異性結合,然后結合的Hb被該菌產(chǎn)生的半胱氨酸蛋白酶降解,從而使包含于Hb內的血紅素釋放以供其利用。有效的鐵攝取機制保障了中間普氏菌在體內的定植和繁殖。 中間普氏菌可誘導hPDLc表達并分泌MMP-9,促進hPDLc表達并分泌MMP-1和TIMP-1,抑制hPDLc分泌TIMP-2。中間普氏菌通過其對MMP表達的廣泛調控而參與牙周結締組織的降解和破壞,從而在慢性牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起一定作用。
【圖文】：

第四軍醫(yī)大學博士學位論文袋、冠周炎、感染根管和頭頸部感染部位中均能檢出中間普氏菌。圖1. 細菌生物膜誘導的宿主反應[9]被激活的巨噬細胞誘導血管發(fā)生改變，血管通透性增高，滲出增加，中性白細胞向炎癥部位趨化。炎性細胞釋放大量酶，，其結果是結締組織、上皮細胞、基底膜被降解。破骨細胞被激活降解牙槽骨。2.2 中間普氏菌的毒力因子中間普氏菌的毒力因子有纖毛、胞外膜泡、溶血素[17-20]、凝血素[21-23]、內毒素、彈性蛋白酶[24]、酸性/堿性磷酸酶[25-27]、胰蛋白酶樣酶、IgG蛋白酶、IgA蛋白酶[28]、可水解酪蛋白、明膠、DNA、RNA、脂類以及其他組織分子的蛋白酶[29-30]等。這些毒力因子的綜合作用造成牙周組織破壞。2.3 中間普氏菌在牙周炎發(fā)病中的作用機制-18-

圖 2. MMP結構模式圖[84,85]sp: 信號肽; pro:前肽區(qū); cr: 前蛋白轉換酶識別序列; cat: 催化結構域; Zn:鋅活性部位; FNII: II 型纖連素基元; Hpx: 血液結合素結構域; L:鏈接肽; Tm: 跨膜結構域; GPI: 糖基磷脂酰肌醇錨定區(qū); Cy: 胞質尾區(qū); CysR: 富半胱氨酸結構域; Ig: 免疫球蛋白結構域 （引自 Nagase et al.2005 和 Sternlich and Werb 2001）MMP-1 主要由人成纖維細胞轉錄和表達，角化細胞、內皮細胞、單核-26-
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R781.4

【引證文獻】

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1 鄒巖;漆正楠;尹君;黃正蔚;何智妍;朱彩蓮;唐子圣;;慢性根尖周炎感染根管內中間普氏菌基因多態(tài)性研究[J];實用口腔醫(yī)學雜志;2012年03期

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1 孫洪濤;煙草對慢性牙周炎齦溝液和人牙齦成纖維細胞中的MMP-9的影響[D];天津醫(yī)科大學;2011年

本文編號：2628005