【摘要】：背景和目的 口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma, OSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一。目前,口腔鱗狀細(xì)胞癌的臨床治療方法仍然是以手術(shù)治療為主,并輔以放射治療和化學(xué)藥物治療。近年來(lái),隨著手術(shù)方式的不斷改進(jìn)以及輔助手段的加強(qiáng),口腔鱗狀細(xì)胞癌的治療效果也逐步得以改善,但其五年生存率仍不足50%。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入,腫瘤的基因治療已經(jīng)成為惡性腫瘤治療研究的新熱點(diǎn)。由于基因治療具有特異性強(qiáng)、損傷小、對(duì)原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶均有效的優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)成為繼手術(shù)、放療和化療之后的新的有希望的治療手段。因此,尋找可用于口腔鱗狀細(xì)胞癌治療的靶基因?qū)τ诳谇击[狀細(xì)胞癌的治療具有十分重要的意義 生長(zhǎng)抑制和DNA損傷基因(growth arrest- and DNA damage-inducible,Gadd)45基因家族由Gadd45α/Gadd45a, Gadd45β/Gadd45b/myd118及Gadd45γ/Gadd45g/cr6組成。其中,Gadd45a基因是DNA損傷后誘導(dǎo)表達(dá)的基因之一,也是抑癌基因p53和乳腺癌相關(guān)蛋白1(Breast Cancer Associated Protein 1,BRCA1)的下游靶基因。細(xì)胞DNA損傷后,Gadd45a基因可以通過(guò)p53依賴及非依賴兩條途徑被誘導(dǎo)表達(dá)升高,參與細(xì)胞周期監(jiān)測(cè)點(diǎn)、細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)及信號(hào)傳導(dǎo)等重要細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)節(jié),并由此介入了對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控。已有研究發(fā)現(xiàn),Gadd45a在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中均存在表達(dá)異常。但是,國(guó)內(nèi)外關(guān)于Gadd45a與口腔鱗狀細(xì)胞癌關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。 為了明確Gadd45a在人口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用,進(jìn)一步以Gadd45a為靶點(diǎn)進(jìn)行基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),本論文從以下三個(gè)方面進(jìn)行了研究： 1. Gadd45a在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其臨床意義 2. Gadd45a基因沉默對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響； 3. Gadd45a基因沉默對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞放療敏感性的影響。 實(shí)驗(yàn)方法 1.探討Gadd45a在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義 1.1.病例的收集：收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院2003-2009年切除的原發(fā)性人口腔鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)標(biāo)本106例,患者均行腫瘤局部擴(kuò)大切除術(shù)及頸淋巴清掃術(shù),術(shù)后病理明確診斷�；颊叩呐R床資料包括年齡、性別、腫瘤組織學(xué)分級(jí)、腫瘤臨床分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等同時(shí)被收集整理。另外選取60例口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的癌旁組織作為對(duì)照。 1.2.采用免疫組化方法檢測(cè)Gadd45a在口腔鱗狀細(xì)胞癌及癌旁組織中的表達(dá)及定位,并分析Gadd45a蛋白表達(dá)及定位與患者臨床資料之間的關(guān)系。 1.3. x2檢驗(yàn)被用來(lái)分析Gadd45a在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤組織學(xué)分級(jí)、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。 2.觀察Gadd45a基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響 2.1.采用免疫熒光技術(shù)觀察Gadd45a蛋白在Tca8113細(xì)胞中的表達(dá)定位。 2.2.采用RNA干擾技術(shù)沉默Tca8113細(xì)胞中Gadd45a基因的表達(dá)：設(shè)計(jì)并合成Gadd45a的特異性干擾序列及無(wú)意義對(duì)照序列,轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞,分別于轉(zhuǎn)染后48h及72h收集細(xì)胞,通過(guò)real time quantitive RT-PCR及Western Blot方法檢測(cè)Gadd45a-siRNA的特異性及有效性。 2.3.采用MTT法檢測(cè)Gadd45a基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖能力的影響：將5×103個(gè)Tca8113細(xì)胞接種于96孔板,待細(xì)胞匯合度達(dá)40%時(shí),將Gadd45a-siRNA及對(duì)照序列轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞,并于轉(zhuǎn)染后24h、48h及72h,用Biotek酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞在490nm的吸光度值。 2.4.特異性靶向人Gadd45a的siRNA序列及無(wú)意義對(duì)照序列分別轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞,并于轉(zhuǎn)染后24小時(shí)收集細(xì)胞,利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)Gadd45a基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)胞周期的影響。 2.5.將轉(zhuǎn)染Gadd45a-siRNA及無(wú)意義對(duì)照序列的Tca8113細(xì)胞以0.25%的胰酶消化、計(jì)數(shù)并接種于Transwell上層小室,置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h,觀察Gadd45a基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)胞遷移能力的影響。 3. Gadd45a基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)胞放療敏感性的影響 3.1.單純放射治療對(duì)Tca8113細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響 1)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Tca8113細(xì)胞接種于6孔板,待細(xì)胞達(dá)到70%融和時(shí),分別給予0Gy、4Gy、10Gy的射線照射,照射后將培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h,通過(guò)倒置顯微鏡及細(xì)胞HE染色觀察不同劑量射線照射對(duì)Tca8113細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。 2)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Tca8113細(xì)胞接種于6孔板,待細(xì)胞達(dá)到70%融和時(shí),分別給予0Gy、2Gy、4Gy、8Gy、10Gy的射線照射,照射后將培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h,通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量放射線對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖的影響。 3)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Tca8113細(xì)胞接種于6孔板,待細(xì)胞達(dá)到70%融和時(shí),分別給予0Gy、2Gy、4Gy、8Gy、10Gy的射線照射,照射后將培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h,收集細(xì)胞,采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)放射線對(duì)Tca8113細(xì)胞凋亡的影響。 4)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Tca8113細(xì)胞接種于6孔板,待細(xì)胞達(dá)到70%融和時(shí),分別給予0Gy、4Gy、10Gy的射線照射,照射后將培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h,收集細(xì)胞,采用流式細(xì)胞技術(shù)分析放射線對(duì)Tca8113細(xì)胞周期的影響。 3.2.放射治療對(duì)Tca8113細(xì)胞Gadd45a基因表達(dá)的影響：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Tca8113細(xì)胞接種6孔板,待細(xì)胞達(dá)到70%融和時(shí),分別給予OGy、4Gy、10Gy的射線照射,照射后將培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h,通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)、real time quantitive RT-PCR和Western Blot方法檢測(cè)放射線對(duì)Tca8113細(xì)胞Gadd45a表達(dá)的影響。 3.3.放射合并Gadd45a基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響 1)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Tca8113細(xì)胞接種6孔板,待細(xì)胞達(dá)到40%融和時(shí),將Gadd45a-siRNA及對(duì)照序列轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞,并于轉(zhuǎn)染后24h,分別給予0Gy、2Gy、4Gy、8Gy、10Gy的射線照射照射后將培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h,利用MTT法觀察Gadd45a-siRNA轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組經(jīng)射線照射后細(xì)胞存活情況。 2)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Tca8113細(xì)胞接種6孔板,待細(xì)胞達(dá)到40%融和時(shí),將Gadd45a-siRNA及對(duì)照序列轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞,并于轉(zhuǎn)染后24h,分別給予0Gy、4Gy、10Gy的射線照射,照射后將培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h,流式細(xì)胞術(shù)分析Gadd45a-siRNA轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組經(jīng)放射線照射后細(xì)胞凋亡情況。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1. Gadd45a在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義口腔鱗狀細(xì)胞癌及癌旁組織的免疫組化染色結(jié)果顯示：口腔鱗狀細(xì)胞癌及癌旁組織均高表達(dá)Gadd45a蛋白。并且,Gadd45a蛋白表達(dá)存在兩種表達(dá)模式,一種是細(xì)胞漿和細(xì)胞核均著色,細(xì)胞核占優(yōu)勢(shì),我們稱之為細(xì)胞核模式；另一種是細(xì)胞漿著色明顯,細(xì)胞核不著色或著色淺,我們稱之為細(xì)胞漿模式。60例癌旁組織中,Gadd45a的表達(dá)均為細(xì)胞核表達(dá)模式。而在106例口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中,只有60例表現(xiàn)為細(xì)胞核模式,其余46例的陽(yáng)性著色部位以細(xì)胞漿為主,細(xì)胞核著色淺或不著色,為細(xì)胞漿模式。近一步的統(tǒng)計(jì)分析表明,口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中Gadd45a表達(dá)模式的轉(zhuǎn)換與患者的年齡、腫瘤的組織學(xué)分級(jí)、腫瘤臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在密切的關(guān)系。年齡＜60歲的腫瘤患者組織中,Gadd45a的表達(dá)以細(xì)胞漿模式為主,而年齡＞60歲的腫瘤患者組織中,Gadd45a的表達(dá)以細(xì)胞核模式為主(p0.05)。Gadd45a表達(dá)模式在不同組織學(xué)分級(jí)的口腔鱗狀細(xì)胞癌之間存在顯著的差異(p＜0.05),高分化及中分化口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中Gadd45a的表達(dá)分布以細(xì)胞核模式為主,而在低分化口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中Gadd45a的表達(dá)分布以細(xì)胞漿模式為主。72.2%的Ⅰ、Ⅱ期腫瘤患者組織中Gadd45a的表達(dá)以細(xì)胞核模式為主,而在Ⅲ、Ⅳ期腫瘤患者中以細(xì)胞核模式表達(dá)Gadd45a的組織標(biāo)本只占48.6%,二者間存在顯著的差異(p＜0.05)。在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤患者組織標(biāo)本中,以細(xì)胞漿模式表達(dá)Gadd45a的比例明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(p＜0.05) 2. Gadd45a基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響 2.1. Gadd45a在Tca8113細(xì)胞中的表達(dá)：為了研究Gadd45a基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用,我們選擇高分化的舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113作為研究對(duì)象。細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示,Gadd45a在Tca8113細(xì)胞中廣泛表達(dá),其著色部位主要在細(xì)胞核,與高分化口腔鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本中Gadd45a的表達(dá)模式基本一致。 2.2. Gadd45a-siRNA干擾效率的檢測(cè)：為了證明Gadd45a-siRNA的特異性及有效性,real time quantitive RT-PCR及Western Blot方法被用來(lái)檢測(cè)Gadd45a-siRNA轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組Tca8113細(xì)胞中Gadd45a的表達(dá),結(jié)果顯示,靶向Gadd45a的siRNA有效抑制了Tca8113細(xì)胞中Gadd45a mRNA及蛋白水平的表達(dá)。 2.3. Gadd45a基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖的影響：我們利用MTT法檢測(cè)了Gadd45a-siRNA轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組Tca8113細(xì)胞的增殖能力,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染Gadd45a-siRNA的Tca8113細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48h及72h的增殖能力較對(duì)照組明顯增強(qiáng)。 2.4. Gadd45a基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)胞周期的影響：利用siRNA技術(shù)將Tca8113細(xì)胞中的Gadd45a基因沉默以后24h,收集細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化,結(jié)果顯示,Gadd45a基因沉默導(dǎo)致Tca8113細(xì)胞G2/M期監(jiān)測(cè)點(diǎn)異常,處于G2期的細(xì)胞比例明顯減少,而S期細(xì)胞的比例顯著增多(p＜0.05) 2.5. Gadd45a基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)胞遷移能力的影響：Gadd45a-siRNA轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組Tca8113細(xì)胞接種于Transwell上層小室,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h,計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù),觀察Gadd45a基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)胞遷移能力的影響,結(jié)果顯示,Gadd45a-siRNA轉(zhuǎn)染組遷移的細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組(p＜0.05),表明Gadd45a基因沉默增強(qiáng)了Tca8113細(xì)胞的遷移能力。 3. Gadd45a基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)胞放療敏感性的影響 3.1.單純射線照射對(duì)Tca8113細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響 1)我們通過(guò)倒置顯微鏡及HE染色技術(shù)觀察了不同劑量射線照射對(duì)Tca8113細(xì)胞形態(tài)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tca8113細(xì)胞經(jīng)10Gy射線照射后24h,細(xì)胞體積變大,細(xì)胞間隙變寬,凋亡及壞死漂浮的細(xì)胞增多,細(xì)胞密度明顯低于未照射或低劑量照射組細(xì)胞。 2) MTT實(shí)驗(yàn)被用來(lái)觀察放射線對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果顯示,4-10Gy放射線有效抑制了Tca8113細(xì)胞的增殖,且呈劑量依賴性 3) Annexin V-PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒被用于檢測(cè)放射線誘導(dǎo)的Tca8113細(xì)胞的凋亡,結(jié)果顯示,4-10Gy射線照射明顯誘導(dǎo)了Tca8113細(xì)胞的凋亡,且呈劑量依賴性。 4)細(xì)胞周期PI染色顯示,10Gy射線照射導(dǎo)致了Tca8113細(xì)胞G2/M期的阻滯,使處于G1及S期的細(xì)胞明顯減少 3.2.放射線照射誘導(dǎo)了Tca8113細(xì)胞Gadd45a基因的表達(dá)上調(diào)：為了研究Gadd45a在口腔鱗狀細(xì)胞癌放療中的作用,我們首先通過(guò)real time quantitive RT-PCR和Western Blot觀察了Tca8113細(xì)胞在接受射線照射前后Gadd45a表達(dá)的變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Tca8113細(xì)胞在接受4Gy或10Gy射線照射后24小時(shí),Gadd45a mRNA水平較照射前明顯升高(0.000965±0.00005 vs 0.000387±0.00002；0.001644±0.000065 vs 0.000387±0.00002)。并且10Gy射線照射亦顯著誘導(dǎo)了Tca8113細(xì)胞Gadd45a蛋白的表達(dá)上調(diào)(p=0.0028)。 3.3. Gadd45a基因沉默合并射線照射對(duì)Tca8113細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響：為了檢測(cè)Gadd45a基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)胞放療敏感性的影響,我們首先利用real time quantitive RT-PCR和Western Blot檢測(cè)了Gadd45a-siRNA的有效性,結(jié)果顯示Gadd45a-siRNA有效抑制了Tca8113細(xì)胞中Gadd45a基因及蛋白水平的表達(dá)(p＜0.05)。隨后我們采用MTT及流式細(xì)胞技術(shù)觀察了siRNA實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組Tca8113細(xì)胞在接受不同劑量射線照射時(shí)細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)及凋亡情況的變化。MTT結(jié)果顯示,Tca8113細(xì)胞在受到4Gy及以上劑量射線照射時(shí),siRNA實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯高于對(duì)照組(p＜0.05)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果也顯示Tca8113細(xì)胞在受到4Gy及10Gy射線照射時(shí),Gadd45a基因沉默組細(xì)胞的凋亡受到明顯抑制,細(xì)胞凋亡分?jǐn)?shù)較對(duì)照組明顯下降(p＜0.05) 結(jié)論 1. Gadd45a在人口腔鱗狀細(xì)胞癌中存在細(xì)胞漿-細(xì)胞核表達(dá)模式的轉(zhuǎn)換,并且Gadd45a的表達(dá)模式與口腔鱗狀細(xì)胞癌的組織學(xué)分級(jí)、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 2. Gadd45a在人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)缺失促進(jìn)了癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移,其機(jī)制可能是通過(guò)干擾細(xì)胞周期調(diào)控以及抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡。 3.放射誘導(dǎo)的人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中Gadd45a基因表達(dá)升高促進(jìn)了細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)了人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。 創(chuàng)新性和意義 1.本研究的創(chuàng)新點(diǎn)是在國(guó)內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)Gadd45a在人口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)存在細(xì)胞漿-細(xì)胞核表達(dá)模式的轉(zhuǎn)換,并且與患者的組織學(xué)分級(jí)及TNM分期有關(guān)。并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí),Gadd45a基因表達(dá)缺失促進(jìn)了舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移。為以Gadd45a為靶點(diǎn)進(jìn)行基因治療提供了理論依據(jù)。 2.本研究首次采用RNA干擾技術(shù)揭示,放射誘導(dǎo)的舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中Gadd45a的表達(dá)升高增強(qiáng)了人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性,為探索口腔鱗狀細(xì)胞癌放療增敏的靶基因提供了新的思路和方向。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R739.85

【參考文獻(xiàn)】

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1 宋詠梅,童彤,付明,董立佳,金順錢,吳e，

本文編號(hào)：2623789