【摘要】：目的： 通過改變E-鈣粘蛋白的N-糖基化以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞粘附連接和緊密連接的穩(wěn)定性來抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移可能是一種新的腫瘤基因治療方法。本實驗將研究低糖基化的E-鈣粘蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Tca8113舌癌細(xì)胞對舌癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。 方法： 1、以Tca8113舌癌細(xì)胞系作為研究樣本,應(yīng)用含低糖基化的E-鈣粘蛋白(V13)基因的質(zhì)粒和含野生型E-鈣粘蛋白(E-cadherin)基因的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Tca8113舌癌細(xì)胞,G418篩選出轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),并且通過western blot實驗檢測轉(zhuǎn)染基因的穩(wěn)定表達(dá)。 2、通過MTT法繪制細(xì)胞生長曲線,觀察細(xì)胞的增殖能力； 3、運用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期,以了解細(xì)胞的增殖活性； 4、應(yīng)用BrdU摻入試驗測定各組細(xì)胞BrdU陽性的比率,以觀察各組細(xì)胞DNA復(fù)制的差異； 綜合上述三項實驗的結(jié)果判定低糖基化的E-鈣粘蛋白(V13)基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Tca8113舌癌細(xì)胞對細(xì)胞增殖活性的影響； 5、通過Transwell小室體外細(xì)胞侵襲實驗觀察相同條件下各實驗組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)的差異,以觀察低糖基化的E-鈣粘蛋白(V13)基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Tca8113舌癌細(xì)胞對細(xì)胞侵襲性能的影響； 6、通過體外細(xì)胞劃痕實驗計算比較各組細(xì)胞間劃痕愈合的差異,以得出低糖基化的E-鈣粘蛋白(V13)基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Tca8113舌癌細(xì)胞對細(xì)胞遷移能力的影響。 結(jié)果： 1. Western blot結(jié)果顯示：低糖基化E-鈣粘蛋白(V13)基因質(zhì)粒和野生型E-鈣粘蛋白基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染舌癌細(xì)胞后均穩(wěn)定表達(dá),以flag抗體作為一抗的western印跡實驗結(jié)果顯示,減少翻譯后N-糖基化修飾的低糖基化E-鈣粘蛋白(V13)的分子量小于野生型E-鈣粘蛋白的分子量,低糖基化E-鈣粘蛋白基因轉(zhuǎn)染的舌癌細(xì)胞表達(dá)的低糖基化E-鈣粘蛋白的分子量為120KD,野生型E-鈣粘蛋白基因轉(zhuǎn)染表達(dá)的野生型E-鈣粘蛋白的分子量為150KD,而空白對照細(xì)胞無flag標(biāo)記的蛋白表達(dá)。 2.MTT結(jié)果顯示：相對于Tca8113空白對照細(xì)胞,低糖基化E-鈣粘蛋白(V13)基因轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞的增殖活性有明顯降低,自48小時后V13轉(zhuǎn)染細(xì)胞的OD比值顯著低于空白對照細(xì)胞,而野生型E-鈣粘蛋白轉(zhuǎn)染的Tca8113細(xì)胞的增殖活性則改變不明顯； 3.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：相對于Tca8113空白對照細(xì)胞,低糖基化E-鈣粘蛋白(V13)基因轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞的S期比率有明顯降低(下調(diào)了約18.42%),而野生型E-鈣粘蛋白轉(zhuǎn)染的Tca8113細(xì)胞的S期細(xì)胞比率則無顯著變化； 4. BrdU摻入實驗結(jié)果顯示：Tca8113空白對照細(xì)胞Brdu陽性細(xì)胞的比率為最高,野生型E-鈣粘蛋白轉(zhuǎn)染的Tca8113細(xì)胞的Brdu陽性率稍低,兩者相比無顯著差異(P0.05),而低糖基化E-鈣粘蛋白(V13)基因轉(zhuǎn)染的Tca8113細(xì)胞Brdu陽性率則顯著降低,與Tca8113對照細(xì)胞之間差異顯著(P0.01)即低糖基化E-鈣粘蛋白(V13)基因轉(zhuǎn)染的Tca8113細(xì)胞合成DNA的能力明顯減弱； 5. Transwell小室體外細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果顯示：相對于Tca8113空白對照細(xì)胞,低糖基化E-鈣粘蛋白(V13)基因轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞侵襲能力明顯降低,而野生型E-鈣粘蛋白轉(zhuǎn)染的Tca8113細(xì)胞侵襲能力則無明顯改變； 6.細(xì)胞劃痕試驗結(jié)果顯示：相對于Tca8113空白對照細(xì)胞,低糖基化E-鈣粘蛋白(V13)基因轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞的遷移能力明顯降低,而野生型E-鈣粘蛋白轉(zhuǎn)染的Tca8113細(xì)胞遷移能力則無顯著變化； 結(jié)論： 低糖基化E-鈣粘蛋白(V13)基因轉(zhuǎn)染比野生型E-鈣粘蛋白基因轉(zhuǎn)染Tca8113舌癌細(xì)胞能更顯著地抑制舌癌細(xì)胞的體外增殖、侵襲性和遷移性。本研究為抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移提供了一種合理、可行的新思路、新途徑,為用低糖基化E-鈣粘蛋白基因轉(zhuǎn)染抑制腫瘤增殖、侵襲和遷移奠定了實驗和理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R739.8

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1 毛，

本文編號：2622749