【摘要】：Runx2是一種胚胎發(fā)育期在牙源性和骨源性間充質細胞中均有表達的轉錄因子。研究顯示，發(fā)育期間其在成骨細胞和成牙本質細胞分化過程中表達趨勢不盡相同，提示分化過程中Runx2特定的表達形式可能是決定細胞向成骨或成牙本質細胞分化的關鍵因子。泛素化修飾可通過控制Runx2蛋白的穩(wěn)定性，調控Runx2的蛋白表達水平，Smurf1是蛋白泛素化降解調控通路中一種重要的E3泛素連接酶，其介導的泛素-蛋白酶體途徑是調控Runx2表達的重要機制。那么Smurf1介導的Runx2泛素化蛋白降解途徑是否在牙髓干細胞向成牙本質細胞分化過程中發(fā)揮著重要的作用呢？ 實驗目的：本課題旨在比較Runx2在成牙本質細胞和成骨細胞分化過程中的表達水平和變化趨勢，并利用shRNA慢病毒表達載體探討牙髓干細胞內Smurf1對Runx2的表達調控作用，以及其在不同分化階段對成牙本質細胞分化表型的影響，以揭示Smurf1介導的Runx2泛素化蛋白降解在牙髓干細胞向成牙本質細胞定向分化中發(fā)揮的調控作用。 實驗方法: 1.人牙髓干細胞（HDPSCs）的分離、培養(yǎng)及鑒定 通過酶消化法和有限稀釋法分離純化出HDPSCs克隆，并進行擴大培養(yǎng)。利用流式細胞技術鑒定其間充質干細胞表面標記物，同時誘導細胞多向分化并進行鑒定。 2.檢測并比較Runx2在干細胞向成牙本質和成骨細胞分化過程中的表達變化 礦化液誘導培養(yǎng)人牙髓干細胞和骨髓間充質干細胞3周，鑒定成牙本質細胞和成骨細胞分化表型，Western blot和實時定量PCR動態(tài)檢測礦化液誘導培養(yǎng)0d,3d,5d,7d,14d,21d成牙分化和成骨分化過程中Runx2的表達變化。 3.探討牙髓干細胞內Runx2表達受Smurf1介導的蛋白降解途徑調控 通過Smurf1shRNA慢病毒轉染技術使牙髓干細胞內Smurf1基因沉默，然后用礦化誘導液誘導細胞分化，Western blot和實時定量PCR檢測Runx2的表達，同時采用蛋白酶體抑制劑MG132和蛋白合成抑制劑cycloheximide分別處理未分化的HDPSCs和Smurf1基因沉默HDPSCs，Western blot檢測Runx2的表達。 4.研究Smurf1對成牙本質細胞分化表型的影響 對Smurf1shRNA轉染的牙髓干細胞進行礦化誘導培養(yǎng)7d和14d，茜素紅染色檢測礦化結節(jié)的形成，Western blot檢測Runx2的表達，實時定量PCR檢測成牙本質細胞相關表型的變化。 結果： 1.細胞鑒定結果證實，所培養(yǎng)細胞為牙髓干細胞（DPSCs），具有干細胞相關特性，并且在礦化液誘導下可分化為成牙本質細胞，經成脂誘導可分化為脂肪細胞。 2. Runx2在人骨髓間充質干細胞向成骨細胞定向分化過程中表達逐漸增高，細胞分化越成熟，表達越強。但在牙髓干細胞向成牙本質細胞定向分化過程中，Runx2表達總體呈先高后低的趨勢，細胞分化早期較未分化時表達增高，到分化晚期和分化成熟時表達則明顯下降。 3.在Smurf1shRNA轉染的未分化HDPSCs內以及細胞經礦化誘導培養(yǎng)7天后，Runx2表達均明顯增加，且這種表達變化僅體現(xiàn)在蛋白水平，Runx2mRNA水平的表達并無明顯變化。蛋白酶體抑制劑MG132可使HDPSCs內Runx2蛋白水平明顯增加，而Smurf1shRNA轉染細胞經可阻斷新蛋白的合成的蛋白合成抑制劑cycloheximide處理后，其內Runx2蛋白半衰期延長，降解速度明顯減慢。 4. Smurf1基因沉默可明顯促進礦化結節(jié)的形成；其對早期礦化基因表達并無明顯影響；而在礦化晚期，而細胞內成牙本質細胞分化相關基因DSPP、DMP-1的表達降低，成骨細胞分化相關基因OCN、BSP的表達則增強。細胞成牙分化減弱，成骨分化增強。同時，Smurf1基因沉默明顯上調了成牙本質細胞分化晚期Runx2的蛋白表達。 結論：Smurf1在牙髓干細胞向成牙本質細胞分化的過程中通過UPS介導了對Runx2的泛素化降解。同時Smurf1還在成牙本質細胞分化晚期發(fā)揮重要作用，而這種作用可能是通過其介導的對Runx2的蛋白酶體降解來實現(xiàn)的，這可能作為一種調控細胞定向分化的關鍵機制參與調控成牙本質細胞的分化。 為了進一步深入研究牙髓干細胞定向分化機制，慢病毒過表達載體將被用于進一步驗證實驗結果，，Runx2shRNA用于深入探討Smurf1介導的Runx2泛素化蛋白降解在成牙本質細胞定向分化中的調控作用，后續(xù)研究將著重于裸鼠體內移植實驗，以研究該調控作用在組織工程領域的應用。
【圖文】：

A. 消化后貼壁的單細胞 B. 7 天后細胞達到 90%融合圖 1 HDPSCs 的原代培養(yǎng)圖（40×）克隆培養(yǎng)后細胞的形態(tài)和生長狀況標記單個細胞生長的孔（圖 2A），在 3d 左右可觀察細胞呈成纖維細胞樣克FU-F）（圖 2B）；大約 7-10 天后，細胞生長迅速并形成大克�。▓D 2C）�？思毎帕惺志o密，從中心向四周呈放散性生長，中心部分細胞大多界限細胞呈短梭形或多角形樣。A B C

第四軍醫(yī)大學碩士學位論文3.3 HDPSCs 的流式細胞鑒定HDPSCs 高表達間充質干細胞標志物 Stro-1（14.9%）、CD29（>95%）、CD90（>95%）、CD105（>85%）以及血管內皮細胞標記分子 CD146（>95%）；不表達造血干細胞標志物 CD34 和 CD45（<5%），與相關文獻結果一致[7]（圖 3）。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R781.3

【參考文獻】

相關期刊論文 前9條

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本文編號：2614149