【摘要】：Runx2是一種胚胎發(fā)育期在牙源性和骨源性間充質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。研究顯示，發(fā)育期間其在成骨細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中表達(dá)趨勢不盡相同，提示分化過程中Runx2特定的表達(dá)形式可能是決定細(xì)胞向成骨或成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子。泛素化修飾可通過控制Runx2蛋白的穩(wěn)定性，調(diào)控Runx2的蛋白表達(dá)水平，Smurf1是蛋白泛素化降解調(diào)控通路中一種重要的E3泛素連接酶，其介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體途徑是調(diào)控Runx2表達(dá)的重要機(jī)制。那么Smurf1介導(dǎo)的Runx2泛素化蛋白降解途徑是否在牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中發(fā)揮著重要的作用呢？ 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模罕菊n題旨在比較Runx2在成牙本質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化過程中的表達(dá)水平和變化趨勢，并利用shRNA慢病毒表達(dá)載體探討牙髓干細(xì)胞內(nèi)Smurf1對Runx2的表達(dá)調(diào)控作用，以及其在不同分化階段對成牙本質(zhì)細(xì)胞分化表型的影響，以揭示Smurf1介導(dǎo)的Runx2泛素化蛋白降解在牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞定向分化中發(fā)揮的調(diào)控作用。 實(shí)驗(yàn)方法: 1.人牙髓干細(xì)胞（HDPSCs）的分離、培養(yǎng)及鑒定 通過酶消化法和有限稀釋法分離純化出HDPSCs克隆，并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。利用流式細(xì)胞技術(shù)鑒定其間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞多向分化并進(jìn)行鑒定。 2.檢測并比較Runx2在干細(xì)胞向成牙本質(zhì)和成骨細(xì)胞分化過程中的表達(dá)變化 礦化液誘導(dǎo)培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞3周，鑒定成牙本質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化表型，Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR動(dòng)態(tài)檢測礦化液誘導(dǎo)培養(yǎng)0d,3d,5d,7d,14d,21d成牙分化和成骨分化過程中Runx2的表達(dá)變化。 3.探討牙髓干細(xì)胞內(nèi)Runx2表達(dá)受Smurf1介導(dǎo)的蛋白降解途徑調(diào)控 通過Smurf1shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)使牙髓干細(xì)胞內(nèi)Smurf1基因沉默，然后用礦化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)細(xì)胞分化，Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR檢測Runx2的表達(dá)，同時(shí)采用蛋白酶體抑制劑MG132和蛋白合成抑制劑cycloheximide分別處理未分化的HDPSCs和Smurf1基因沉默HDPSCs，Western blot檢測Runx2的表達(dá)。 4.研究Smurf1對成牙本質(zhì)細(xì)胞分化表型的影響 對Smurf1shRNA轉(zhuǎn)染的牙髓干細(xì)胞進(jìn)行礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)7d和14d，茜素紅染色檢測礦化結(jié)節(jié)的形成，Western blot檢測Runx2的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR檢測成牙本質(zhì)細(xì)胞相關(guān)表型的變化。 結(jié)果： 1.細(xì)胞鑒定結(jié)果證實(shí)，所培養(yǎng)細(xì)胞為牙髓干細(xì)胞（DPSCs），具有干細(xì)胞相關(guān)特性，并且在礦化液誘導(dǎo)下可分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)成脂誘導(dǎo)可分化為脂肪細(xì)胞。 2. Runx2在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞定向分化過程中表達(dá)逐漸增高，細(xì)胞分化越成熟，表達(dá)越強(qiáng)。但在牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞定向分化過程中，Runx2表達(dá)總體呈先高后低的趨勢，細(xì)胞分化早期較未分化時(shí)表達(dá)增高，到分化晚期和分化成熟時(shí)表達(dá)則明顯下降。 3.在Smurf1shRNA轉(zhuǎn)染的未分化HDPSCs內(nèi)以及細(xì)胞經(jīng)礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后，Runx2表達(dá)均明顯增加，且這種表達(dá)變化僅體現(xiàn)在蛋白水平，Runx2mRNA水平的表達(dá)并無明顯變化。蛋白酶體抑制劑MG132可使HDPSCs內(nèi)Runx2蛋白水平明顯增加，而Smurf1shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)可阻斷新蛋白的合成的蛋白合成抑制劑cycloheximide處理后，其內(nèi)Runx2蛋白半衰期延長，降解速度明顯減慢。 4. Smurf1基因沉默可明顯促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成；其對早期礦化基因表達(dá)并無明顯影響；而在礦化晚期，而細(xì)胞內(nèi)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化相關(guān)基因DSPP、DMP-1的表達(dá)降低，成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因OCN、BSP的表達(dá)則增強(qiáng)。細(xì)胞成牙分化減弱，成骨分化增強(qiáng)。同時(shí)，Smurf1基因沉默明顯上調(diào)了成牙本質(zhì)細(xì)胞分化晚期Runx2的蛋白表達(dá)。 結(jié)論：Smurf1在牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的過程中通過UPS介導(dǎo)了對Runx2的泛素化降解。同時(shí)Smurf1還在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化晚期發(fā)揮重要作用，而這種作用可能是通過其介導(dǎo)的對Runx2的蛋白酶體降解來實(shí)現(xiàn)的，這可能作為一種調(diào)控細(xì)胞定向分化的關(guān)鍵機(jī)制參與調(diào)控成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化。 為了進(jìn)一步深入研究牙髓干細(xì)胞定向分化機(jī)制，慢病毒過表達(dá)載體將被用于進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，，Runx2shRNA用于深入探討Smurf1介導(dǎo)的Runx2泛素化蛋白降解在成牙本質(zhì)細(xì)胞定向分化中的調(diào)控作用，后續(xù)研究將著重于裸鼠體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)，以研究該調(diào)控作用在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用。
【圖文】：

A. 消化后貼壁的單細(xì)胞 B. 7 天后細(xì)胞達(dá)到 90%融合圖 1 HDPSCs 的原代培養(yǎng)圖（40×）克隆培養(yǎng)后細(xì)胞的形態(tài)和生長狀況標(biāo)記單個(gè)細(xì)胞生長的孔（圖 2A），在 3d 左右可觀察細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣克FU-F）（圖 2B）；大約 7-10 天后，細(xì)胞生長迅速并形成大克�。▓D 2C）�？思�(xì)胞排列十分緊密，從中心向四周呈放散性生長，中心部分細(xì)胞大多界限細(xì)胞呈短梭形或多角形樣。A B C

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文3.3 HDPSCs 的流式細(xì)胞鑒定HDPSCs 高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物 Stro-1（14.9%）、CD29（>95%）、CD90（>95%）、CD105（>85%）以及血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記分子 CD146（>95%）；不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物 CD34 和 CD45（<5%），與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果一致[7]（圖 3）。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R781.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2614149