【摘要】：牙菌斑生物膜(Dental plaque biofilm)是齲病發(fā)生的始動因子,菌斑中致齲菌通過多個毒力因子在齲病的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用,主要表現(xiàn)在粘附、產酸和耐酸三個環(huán)節(jié)。其中耐酸是致齲菌最重要的生物學特征同時也是齲病發(fā)生的前提,只有能耐受酸性環(huán)境,致齲菌才能繼續(xù)代謝并產酸,最終導致釉質發(fā)生脫礦而引起齲病的發(fā)生。質子移位膜ATP酶(membrane-bound proton-translocating ATPase, F0F1ATPase, F-ATPase, H+-ATPase, F-type ATPsae)能通過轉運質子于胞外以維持細胞內相對中性的環(huán)境,從而保護胞內的對酸敏感的酶和其他蛋白,使致齲菌具有對抗酸致死的能力,并在低pH條件下存活繼續(xù)產酸,從而達到臨界pH使釉質脫礦,因此,F-ATPase是致齲菌最重要的耐酸毒力因子。牙菌斑生物膜是致齲菌致病的原位環(huán)境,它并非細菌結構上簡單疊加,而是構建起復雜的微生物群落,具有生物膜結構和微生物生理學的功能,生物膜內細菌之間存在相互拮抗、相互依賴以及信號傳導,啟動一套完全不同于浮游狀態(tài)的基因系統(tǒng),影響致齲菌毒力因子表達和毒理作用,故觀察生物膜中F-ATPase的表達能真實準確地反應致齲菌耐酸毒力因子在齲病發(fā)生發(fā)展過程中的作用。目的：本課題檢測耐酸因子F-ATPase在多細菌人工口腔生物膜(體外生物膜,artificial biofilm, in vitro biofilm)和臨床不同齲敏感個體原位菌斑中的基因表達特點及酶的活性,并觀察F-ATPase啟動子熒光報告基因重組質粒轉化的細菌在不同pH生物膜環(huán)境中的熒光表達,初步分析毒力因子F-ATPase在生物膜中基因和蛋白的表達水平,對進一步明確齲病的病因、疾病風險性評估以及防治均有重要意義。 方法： 一、熒光定量PCR檢測人工口腔生物膜中F-ATPase在不同pH條件下的mRNA表達差異 以變異鏈球菌(S. mutans)、血鏈球菌(S.sanguis)、遠緣鏈球菌(S.sobrinus)、內氏放線菌(A. naeslundii)、粘性放線菌(A. viscosus)、口腔鏈球菌(S.oralis)和奈瑟氏菌(Neisseria)8種口腔與齲相關菌構建口腔體外生物膜模型,不同pH環(huán)境中生長3h后,提取生物膜樣本的RNA,逆轉錄cDNA,熒光定量PCR (SYBR Green I)檢測F-ATPase的mRNA表達。單因素方差分析統(tǒng)計結果。 二、熒光定量PCR檢測不同齲敏感個體牙菌斑生物膜中F-ATPase的mRNA表達 分別采集成年人高齲(61例)和無齲(50例)、老年人根面高齲(56例)和根面無齲(41例)人群的牙菌斑,提取菌斑RNA,逆轉錄cDNA,熒光定量PCR (SYBR GreenⅠ)檢測牙菌斑F-ATPase的mRNA表達。單因素方差分析統(tǒng)計結果。 三、人工口腔生物膜中F-ATPase的酶活性表達 實驗一相同方法構建人工口腔生物膜,制備混合細菌生物膜透性細胞,以檢測不同pH條件下磷的釋放量來反映F-ATPase酶活性。單因素方差分析統(tǒng)計結果。 四、前期構建的F-ATPase啟動子轉化菌生長及重組熒光表達載體在人工口腔生物膜中的熒光表達特點 課題前期構建的F-ATPase啟動子綠色熒光蛋白穿梭載體PLFgfp和管家基因recA紅色熒光蛋白穿梭載體PLRred,質粒DNA電擊轉化變異鏈球菌(UA159),觀察不同pH條件的生長菌在含卡那霉素BHI瓊脂平板的菌落生長情況,激光共聚焦掃描顯微鏡觀察兩種穿梭載體在大腸桿菌中不同pH生物膜條件下熒光的表達。 結果： 1.人工口腔生物膜中F-ATPase在不同pH條件下表達不同,在初始pH 5和5.5時F-ATPase表達最高,然后依次是初始pH 6、6.5、4.5、7,在初始pH 4時表達最低。酸性環(huán)境相對中性環(huán)境(pH 7) F-ATPase的表達差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 2.高齲組人群F-ATPase的表達明顯高于無齲組(P0.01),高齲組中成年人F-ATPase的表達高于老年人(P0.01),而無齲組中成年人與老年人差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。F-ATPase在臨床個體原位牙菌斑生物膜中的表達遠遠高于人工口腔生物膜(P0.01)。 3.在酸處理初期前10min, F-ATPase活性隨pH升高而降低；經過3h穩(wěn)定培養(yǎng)后,pH 5和5.5時活性最高,其他依次是pH 6、pH 4.5、pH 6.5、pH 4,在pH 7時活性最弱。相對中性環(huán)境(pH 7)酸性環(huán)境F-ATPase的活性差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 4. F-ATPase啟動子重組質粒電擊轉化后的變異鏈球菌能夠生長在含卡那霉素的BHI平板上,PCR擴增結果證實轉化成功,轉化菌在pH 5.5的卡那霉素抗性平板上生長率最高,然后依次是pH 5、pH 6、pH 6.5、pH 7、pH 4.5,生長率最低的是pH 4,結果類似于不同pH培養(yǎng)后的多細菌人工口腔生物膜F-ATPase的表達。F-ATPase啟動子及內參照recA啟動子重組質粒轉化后的大腸桿菌同實驗一條件構建不同pH人工口腔生物膜,激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察熒光表達,結果顯示：綠色熒光(F-ATPase啟動子重組質粒)在初始pH為5.5的條件中表達最多,然后依次是初始pH 5、pH 6、pH 4.5、pH 6.5、pH 4和pH 7,而紅色熒光(內參照recA啟動子重組質粒)的表達在初始pH 7時最高,隨著pH降低減少,在初始pH 4時表達較少。 結論： 生物膜中,pH值影響F-ATPase基因和活性的表達,在初始pH 5-5.5環(huán)境中基因表達和酶活性都最高,變異鏈球菌F-ATPase啟動子熒光蛋白在初始pH 5.5環(huán)境中表達也最強(pH 5-5.5是牙釉質脫礦與再礦化失衡致齲病發(fā)生的臨界pH)；高齲人群原位菌斑中F-ATPase表達遠遠高于無齲人群,可見菌斑生物膜中的致齲微生物通過F-ATPase的基因表達上調和蛋白表達增強在低pH環(huán)境中酸耐受并致齲。
【圖文】：

培養(yǎng)基pH為4、4.5、5、5.5、6、6.5、7的終末pH分別為3.50士0.22、3.63士0.29、3.77士0.21、3.97士0.27、4.06士0.23、4.29士0.30、4.71士0.26。培養(yǎng)前后pH變化(見圖1一4)81----一--一---一一.初始pH.終末pH圖1一4混合細菌培養(yǎng)前后培養(yǎng)基PH變化圖Fig.l一 4BeforeandaftertheehangeofbaeterialeulturemediumPH3.5細菌RNA提取

位論文生物膜中耐酸因子F一ATPase的表達與齲病的關系遠緣鏈球菌奈瑟氏菌圖1一3細菌革蘭染色(x100)Fig.l一 3Thegram’ sstainofbaeteria 3.4培養(yǎng)基終末PH測定混合細菌生物膜培養(yǎng)后不同PH環(huán)境下生長3h，，測定各培養(yǎng)皿中的終末pH，初始培養(yǎng)基pH為4、4.5、5、5.5、6、6.5、7的終末pH分別為3.50士0.22、3.63士0.29、3.77士0.21、3.97士0.27、4.06士0.23、4.29士0.30、4.71士0.26。培養(yǎng)前后pH變化(見圖1一4)81----一--一---一一.初始pH.終末pH圖1一4混合細菌培養(yǎng)前后培養(yǎng)基PH變化圖Fig.l一 4BeforeandaftertheehangeofbaeterialeulturemediumPH3.5細菌RNA提取
【學位授予單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R781.1

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 衛(wèi)華;變形鏈球菌耐酸性相關基因的研究[J];國外醫(yī)學.口腔醫(yī)學分冊;2002年03期

2 楊德琴;變形鏈球菌質子移位膜ATP酶研究進展[J];國外醫(yī)學.口腔醫(yī)學分冊;2004年03期

3 楊德琴;劉天佳;付春華;亓慶國;莊Y

本文編號：2609850