【摘要】：牙菌斑生物膜(Dental plaque biofilm)是齲病發(fā)生的始動因子,菌斑中致齲菌通過多個毒力因子在齲病的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用,主要表現(xiàn)在粘附、產(chǎn)酸和耐酸三個環(huán)節(jié)。其中耐酸是致齲菌最重要的生物學(xué)特征同時也是齲病發(fā)生的前提,只有能耐受酸性環(huán)境,致齲菌才能繼續(xù)代謝并產(chǎn)酸,最終導(dǎo)致釉質(zhì)發(fā)生脫礦而引起齲病的發(fā)生。質(zhì)子移位膜ATP酶(membrane-bound proton-translocating ATPase, F0F1ATPase, F-ATPase, H+-ATPase, F-type ATPsae)能通過轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子于胞外以維持細(xì)胞內(nèi)相對中性的環(huán)境,從而保護(hù)胞內(nèi)的對酸敏感的酶和其他蛋白,使致齲菌具有對抗酸致死的能力,并在低pH條件下存活繼續(xù)產(chǎn)酸,從而達(dá)到臨界pH使釉質(zhì)脫礦,因此,F-ATPase是致齲菌最重要的耐酸毒力因子。牙菌斑生物膜是致齲菌致病的原位環(huán)境,它并非細(xì)菌結(jié)構(gòu)上簡單疊加,而是構(gòu)建起復(fù)雜的微生物群落,具有生物膜結(jié)構(gòu)和微生物生理學(xué)的功能,生物膜內(nèi)細(xì)菌之間存在相互拮抗、相互依賴以及信號傳導(dǎo),啟動一套完全不同于浮游狀態(tài)的基因系統(tǒng),影響致齲菌毒力因子表達(dá)和毒理作用,故觀察生物膜中F-ATPase的表達(dá)能真實(shí)準(zhǔn)確地反應(yīng)致齲菌耐酸毒力因子在齲病發(fā)生發(fā)展過程中的作用。目的：本課題檢測耐酸因子F-ATPase在多細(xì)菌人工口腔生物膜(體外生物膜,artificial biofilm, in vitro biofilm)和臨床不同齲敏感個體原位菌斑中的基因表達(dá)特點(diǎn)及酶的活性,并觀察F-ATPase啟動子熒光報告基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在不同pH生物膜環(huán)境中的熒光表達(dá),初步分析毒力因子F-ATPase在生物膜中基因和蛋白的表達(dá)水平,對進(jìn)一步明確齲病的病因、疾病風(fēng)險性評估以及防治均有重要意義。 方法： 一、熒光定量PCR檢測人工口腔生物膜中F-ATPase在不同pH條件下的mRNA表達(dá)差異 以變異鏈球菌(S. mutans)、血鏈球菌(S.sanguis)、遠(yuǎn)緣鏈球菌(S.sobrinus)、內(nèi)氏放線菌(A. naeslundii)、粘性放線菌(A. viscosus)、口腔鏈球菌(S.oralis)和奈瑟氏菌(Neisseria)8種口腔與齲相關(guān)菌構(gòu)建口腔體外生物膜模型,不同pH環(huán)境中生長3h后,提取生物膜樣本的RNA,逆轉(zhuǎn)錄cDNA,熒光定量PCR (SYBR Green I)檢測F-ATPase的mRNA表達(dá)。單因素方差分析統(tǒng)計結(jié)果。 二、熒光定量PCR檢測不同齲敏感個體牙菌斑生物膜中F-ATPase的mRNA表達(dá) 分別采集成年人高齲(61例)和無齲(50例)、老年人根面高齲(56例)和根面無齲(41例)人群的牙菌斑,提取菌斑RNA,逆轉(zhuǎn)錄cDNA,熒光定量PCR (SYBR GreenⅠ)檢測牙菌斑F-ATPase的mRNA表達(dá)。單因素方差分析統(tǒng)計結(jié)果。 三、人工口腔生物膜中F-ATPase的酶活性表達(dá) 實(shí)驗(yàn)一相同方法構(gòu)建人工口腔生物膜,制備混合細(xì)菌生物膜透性細(xì)胞,以檢測不同pH條件下磷的釋放量來反映F-ATPase酶活性。單因素方差分析統(tǒng)計結(jié)果。 四、前期構(gòu)建的F-ATPase啟動子轉(zhuǎn)化菌生長及重組熒光表達(dá)載體在人工口腔生物膜中的熒光表達(dá)特點(diǎn) 課題前期構(gòu)建的F-ATPase啟動子綠色熒光蛋白穿梭載體PLFgfp和管家基因recA紅色熒光蛋白穿梭載體PLRred,質(zhì)粒DNA電擊轉(zhuǎn)化變異鏈球菌(UA159),觀察不同pH條件的生長菌在含卡那霉素BHI瓊脂平板的菌落生長情況,激光共聚焦掃描顯微鏡觀察兩種穿梭載體在大腸桿菌中不同pH生物膜條件下熒光的表達(dá)。 結(jié)果： 1.人工口腔生物膜中F-ATPase在不同pH條件下表達(dá)不同,在初始pH 5和5.5時F-ATPase表達(dá)最高,然后依次是初始pH 6、6.5、4.5、7,在初始pH 4時表達(dá)最低。酸性環(huán)境相對中性環(huán)境(pH 7) F-ATPase的表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 2.高齲組人群F-ATPase的表達(dá)明顯高于無齲組(P0.01),高齲組中成年人F-ATPase的表達(dá)高于老年人(P0.01),而無齲組中成年人與老年人差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。F-ATPase在臨床個體原位牙菌斑生物膜中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于人工口腔生物膜(P0.01)。 3.在酸處理初期前10min, F-ATPase活性隨pH升高而降低；經(jīng)過3h穩(wěn)定培養(yǎng)后,pH 5和5.5時活性最高,其他依次是pH 6、pH 4.5、pH 6.5、pH 4,在pH 7時活性最弱。相對中性環(huán)境(pH 7)酸性環(huán)境F-ATPase的活性差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 4. F-ATPase啟動子重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化后的變異鏈球菌能夠生長在含卡那霉素的BHI平板上,PCR擴(kuò)增結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)化成功,轉(zhuǎn)化菌在pH 5.5的卡那霉素抗性平板上生長率最高,然后依次是pH 5、pH 6、pH 6.5、pH 7、pH 4.5,生長率最低的是pH 4,結(jié)果類似于不同pH培養(yǎng)后的多細(xì)菌人工口腔生物膜F-ATPase的表達(dá)。F-ATPase啟動子及內(nèi)參照recA啟動子重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌同實(shí)驗(yàn)一條件構(gòu)建不同pH人工口腔生物膜,激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察熒光表達(dá),結(jié)果顯示：綠色熒光(F-ATPase啟動子重組質(zhì)粒)在初始pH為5.5的條件中表達(dá)最多,然后依次是初始pH 5、pH 6、pH 4.5、pH 6.5、pH 4和pH 7,而紅色熒光(內(nèi)參照recA啟動子重組質(zhì)粒)的表達(dá)在初始pH 7時最高,隨著pH降低減少,在初始pH 4時表達(dá)較少。 結(jié)論： 生物膜中,pH值影響F-ATPase基因和活性的表達(dá),在初始pH 5-5.5環(huán)境中基因表達(dá)和酶活性都最高,變異鏈球菌F-ATPase啟動子熒光蛋白在初始pH 5.5環(huán)境中表達(dá)也最強(qiáng)(pH 5-5.5是牙釉質(zhì)脫礦與再礦化失衡致齲病發(fā)生的臨界pH)；高齲人群原位菌斑中F-ATPase表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于無齲人群,可見菌斑生物膜中的致齲微生物通過F-ATPase的基因表達(dá)上調(diào)和蛋白表達(dá)增強(qiáng)在低pH環(huán)境中酸耐受并致齲。
【圖文】：

培養(yǎng)基pH為4、4.5、5、5.5、6、6.5、7的終末pH分別為3.50士0.22、3.63士0.29、3.77士0.21、3.97士0.27、4.06士0.23、4.29士0.30、4.71士0.26。培養(yǎng)前后pH變化(見圖1一4)81----一--一---一一.初始pH.終末pH圖1一4混合細(xì)菌培養(yǎng)前后培養(yǎng)基PH變化圖Fig.l一 4BeforeandaftertheehangeofbaeterialeulturemediumPH3.5細(xì)菌RNA提取

位論文生物膜中耐酸因子F一ATPase的表達(dá)與齲病的關(guān)系遠(yuǎn)緣鏈球菌奈瑟氏菌圖1一3細(xì)菌革蘭染色(x100)Fig.l一 3Thegram’ sstainofbaeteria 3.4培養(yǎng)基終末PH測定混合細(xì)菌生物膜培養(yǎng)后不同PH環(huán)境下生長3h，，測定各培養(yǎng)皿中的終末pH，初始培養(yǎng)基pH為4、4.5、5、5.5、6、6.5、7的終末pH分別為3.50士0.22、3.63士0.29、3.77士0.21、3.97士0.27、4.06士0.23、4.29士0.30、4.71士0.26。培養(yǎng)前后pH變化(見圖1一4)81----一--一---一一.初始pH.終末pH圖1一4混合細(xì)菌培養(yǎng)前后培養(yǎng)基PH變化圖Fig.l一 4BeforeandaftertheehangeofbaeterialeulturemediumPH3.5細(xì)菌RNA提取
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R781.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 衛(wèi)華;變形鏈球菌耐酸性相關(guān)基因的研究[J];國外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊;2002年03期

2 楊德琴;變形鏈球菌質(zhì)子移位膜ATP酶研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊;2004年03期

3 楊德琴;劉天佳;付春華;亓慶國;莊Y

本文編號：2609850