【摘要】： 氟化物在口腔醫(yī)學(xué)中有著廣泛的應(yīng)用,在牙本質(zhì)過(guò)敏、防齲、礦化機(jī)制和氟斑牙預(yù)防研究中扮演重要角色,在生活和臨床中被大量使用。已有研究發(fā)現(xiàn)高氟暴露的牙本質(zhì)礦化受到影響,高氟作用下多種細(xì)胞的礦化相關(guān)因子表達(dá)發(fā)生變化。牙髓的損傷刺激往往導(dǎo)致局部成牙本質(zhì)細(xì)胞凋亡或壞死,喪失其形成牙本質(zhì)的功能,同時(shí)也觀察到受損區(qū)牙本質(zhì)管樣結(jié)構(gòu)的修復(fù)性牙本質(zhì)的形成,這說(shuō)明了成牙本質(zhì)細(xì)胞的凋亡是牙髓損傷修復(fù)中的重要現(xiàn)象,在牙髓損傷和修復(fù)的中間環(huán)節(jié)扮演重要角色。 又有研究認(rèn)為氟作用下的細(xì)胞膜氯離子通道受到影響,硫的轉(zhuǎn)運(yùn)增加,有可能與礦化相關(guān)蛋白的表達(dá),調(diào)控,修飾相互作用。進(jìn)而推測(cè)其影響細(xì)胞礦化模式,促進(jìn)硬組織的損傷修復(fù)過(guò)程。 由于成牙本質(zhì)細(xì)胞在牙本質(zhì)發(fā)育和改建扮演重要角色,能夠在人一生之中不斷地分泌成牙本質(zhì)基質(zhì),生成修復(fù)牙本質(zhì)。所以研究氟化物誘導(dǎo)下成牙本質(zhì)細(xì)胞凋亡的適宜濃度和時(shí)間、牙本質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡的分子信號(hào)通路對(duì)于探索氟化物治療牙本質(zhì)過(guò)敏機(jī)制、探尋氟化物調(diào)控的硬組織礦化機(jī)制有重要的意義。 本研究從確定氟誘導(dǎo)的濃度,觀察凋亡的發(fā)生,以及細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路等不同層次,展開(kāi)四個(gè)實(shí)驗(yàn): 實(shí)驗(yàn)一:氟對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞的增殖抑制。 本實(shí)驗(yàn)觀察了成牙本質(zhì)細(xì)胞系(odontoblast-lineage cell, OLC)的生物學(xué)行為和氟刺激下的細(xì)胞形態(tài)變化。以不含血清的DMEM培養(yǎng)基孵育12h后,分別換以含NaF 0-6mmol/L濃度的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基分別培養(yǎng)12-48h后觀察細(xì)胞形態(tài)變化。繼而采用MTT法和臺(tái)盼蘭排斥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)氟對(duì)OLC細(xì)胞的增殖抑制。結(jié)果:細(xì)胞在氟的作用下增殖分裂緩慢,4mmol濃度作用24小時(shí)抑制率可以達(dá)到50%以上。推測(cè)4mmol濃度作用12-24小時(shí)后可能誘導(dǎo)OLC細(xì)胞的凋亡出現(xiàn)。 實(shí)驗(yàn)二:氟誘導(dǎo)的成牙本質(zhì)細(xì)胞系細(xì)胞的凋亡 為了進(jìn)一步觀察氟誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞的凋亡,我們采用流式細(xì)胞術(shù)、原位末端標(biāo)記法發(fā)現(xiàn)氟化鈉能夠誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡,采用透射電鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡后的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,在4mmol/L濃度下,western blot試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了凋亡發(fā)生晚期重要的caspase-3蛋白發(fā)生了剪切,表明此濃度的氟誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆轉(zhuǎn)的狀態(tài)。 實(shí)驗(yàn)三:氟化物通過(guò)MAPK途徑誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞凋亡。 為了進(jìn)一步觀察MAPK通路對(duì)于成牙本質(zhì)細(xì)胞凋亡的意義,本實(shí)驗(yàn)采用western blot技術(shù)對(duì)JNK、ERK和p38及其磷酸化蛋白進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)JNK蛋白隨著濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng),磷酸化程度不斷增強(qiáng)。ERK的磷酸化過(guò)程在時(shí)間上表現(xiàn)為短期內(nèi)升高,降低后又升高的過(guò)程.但是隨著濃度增加而升高。p38未檢測(cè)到磷酸化改變。JNK抑制劑SP600125可以有效抑制JNK的磷酸化改變,ERK的抑制劑PD98059可以抑制部分磷酸化過(guò)程。這表明JNK信號(hào)通路參與了氟誘導(dǎo)的成牙本質(zhì)細(xì)胞凋亡,而ERK信號(hào)通路部分參與了此凋亡過(guò)程,p38則未參與氟化物誘導(dǎo)的成牙本質(zhì)細(xì)胞凋亡。 實(shí)驗(yàn)四:線粒體途徑對(duì)氟化物誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響。 為了進(jìn)一步觀察凋亡的另一經(jīng)典通路,線粒體信號(hào)通路對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響,我們又采用免疫組化法,使用MitoTracker deep red 633線粒體熒光探針標(biāo)記線粒體,觀察Bax在線粒體內(nèi)的定位情況,結(jié)合western blot檢測(cè)凋亡的線粒體途徑中重要的兩個(gè)分子Bax和Bcl-2的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)Bax轉(zhuǎn)位至線粒體并定位于線粒體外膜上,而B(niǎo)ax表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加,顯示凋亡不斷進(jìn)展,Bcl-2作為抗凋亡蛋白,在氟誘導(dǎo)過(guò)程中增高以對(duì)抗凋亡的發(fā)生,48小時(shí)后降低可能是凋亡進(jìn)入不可逆轉(zhuǎn)過(guò)程。這些表明了線粒體途徑參與了氟誘導(dǎo)的成牙本質(zhì)細(xì)胞凋亡。 本研究初步證實(shí)了氟化物能夠誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞系發(fā)生凋亡,并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MAPK通路和線粒體途徑都在OLC細(xì)胞凋亡中的扮演了重要角色。
【圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位樣，繼續(xù)培養(yǎng)可見(jiàn)細(xì)胞重疊生長(zhǎng)，新分裂細(xì)胞在低密度時(shí)生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)至 50%以上分裂明顯現(xiàn)細(xì)胞結(jié)節(jié)，細(xì)胞繼續(xù)增殖受到抑制，第 6 天胞死亡。

圖 1.OLC 細(xì)胞低倍鏡下觀。細(xì)胞呈成纖維狀，長(zhǎng)梭形,2-3 個(gè)突,體積較大,胞體豐滿,核仁清晰，，生長(zhǎng) 3-4 天伸展鋪滿瓶底如“鋪路Fig1. Morphology of OLC cell
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R78

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本文編號(hào)：2609685