【摘要】：目的以大鼠顳下頌髁突軟骨細(xì)胞為體外模型,用白細(xì)胞介素-1β模擬顳下頌關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎中的細(xì)胞環(huán)境,探究一氧化碳釋放分子-3對白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原及凋亡相關(guān)因子Bax/Bcl-2的影響和可能的機(jī)制。方法取3-4周齡,體重約為100克左右的Wistar大鼠,無菌條件下分離髁突軟骨(位于髁突頭部,呈乳白色),用0.25%胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶交替消化后進(jìn)行大鼠髁突軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng),顯微鏡下觀察。取第二代細(xì)胞制作爬片,配置甲苯胺藍(lán)染色液,行細(xì)胞鑒定;取第三代細(xì)胞加藥處理,提取總RNA和總蛋白,具體條件為用白細(xì)胞介素-1β處理細(xì)胞24小時(shí),濃度分別為0,1,5和1Ong/ml,收集細(xì)胞用于進(jìn)一步分析。從基因和蛋白水平分別檢測各組細(xì)胞中Ⅱ型膠原及凋亡相關(guān)因子Bax/Bcl-2的表達(dá)變化,以此確定誘導(dǎo)髁突軟骨細(xì)胞的最佳白細(xì)胞介素-1β工作濃度;細(xì)胞分別用濃度為100,200,400μM的一氧化碳釋放分子-3(CORM-3)預(yù)處理24小時(shí)后,棄原培養(yǎng)基,換用1Ong/ml白細(xì)胞介素-1β處理,24小時(shí)后使用CCK-8測定法檢測細(xì)胞的活力,提取總RNA,進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng),檢測相關(guān)基因Ⅱ型膠原和Bax/Bcl-2的表達(dá),以此確定后面實(shí)驗(yàn)最佳的一氧化碳釋放分子-3工作濃度;接著將活性較好的軟骨細(xì)胞用200μMCORM-3和degassed CORM-3(提前24小時(shí)配置并釋放完一氧化碳?xì)怏w)預(yù)處理,24小時(shí)后換用10ng/ml白細(xì)胞介素-1β刺激。收集細(xì)胞并取適量懸液,應(yīng)用凋亡試劑盒后上機(jī)檢測凋亡情況,提取總蛋白,用蛋白印記法檢測相關(guān)蛋白Ⅱ型膠原和Bax/Bcl-2的表達(dá);為了探究可能的機(jī)制,取上述總蛋白用蛋白印跡法檢測各組中血紅素加氧酶-1的表達(dá)情況。結(jié)果①鏡下觀察分離后的軟骨細(xì)胞貼壁后呈多角形,培養(yǎng)7-8天后達(dá)到匯合狀態(tài),似“鋪路石”狀。傳代后細(xì)胞較原代分布均勻,增殖速率加快,細(xì)胞狀態(tài)良好。第四代以后的細(xì)胞呈不規(guī)則生長,部分細(xì)胞似有觸角伸出,形狀由多角形轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形,生長速率明顯變慢;鏡下觀察染色后的細(xì)胞,多數(shù)胞核為圓形,呈深藍(lán)色,胞質(zhì)呈淡藍(lán)色,細(xì)胞間有大量深藍(lán)色的顆粒狀物質(zhì),為分泌到細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白聚糖。②髁突軟骨細(xì)胞中Bax mRNA和蛋白的表達(dá)隨著IL-1 β濃度的升高而增加,Bcl-2以及細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原mRNA和蛋白的表達(dá)隨著IL-1β濃度的升高而降低,且都呈劑量依賴性,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇1Ong/ml作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的IL-1β工作濃度。③用濃度為100,200,400μM的CORM-3預(yù)處理細(xì)胞后,與IL-1β刺激組比較,髁突軟骨細(xì)胞存活率明顯提高,細(xì)胞中Bax mRNA的表達(dá)顯著降低,Bcl-2和Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且20μM CORM-3預(yù)處理組作用效果最顯著,200μM可作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳工作濃度。④流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,IL-1β+200μM CORM-3預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率明顯低于IL-1β刺激組,CORM-3對細(xì)胞凋亡的影響是由其釋放的CO介導(dǎo)的,degassed CORM-3預(yù)處理組不能抑制細(xì)胞凋亡,其凋亡率與IL-1β刺激組比較無明顯差異;degassed CORM-3預(yù)處理后消除了正常CORM-3對IL-1 β刺激的細(xì)胞中Bax,Bcl-2和Ⅱ型膠原表達(dá)的調(diào)節(jié)作用;⑤degassed CORM-3預(yù)處理組細(xì)胞中HO-1蛋白表達(dá)與IL-1β刺激組相比無顯著差異,而200μM CORM-3預(yù)處理組細(xì)胞中HO-1蛋白表達(dá)較IL-1β刺激組和degassed CORM-3預(yù)處理組顯著增加。結(jié)論一氧化碳釋放分子-3可抑制白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的大鼠髁突軟骨細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞中Bcl-2及Ⅱ型膠原的表達(dá)同時(shí)減少Bax的產(chǎn)生;可能的機(jī)制為一氧化碳釋放分子-3激活血紅素加氧酶-1蛋白來發(fā)揮其抗凋亡的作用。
【圖文】：

原代髁突軟骨細(xì)胞（７邋ｄａｙｓ邋４0ｘ）邐原代髁突軟骨細(xì)胞（７邋ｄａｙｓ邋１０0ｘ）逡逑圖１－１大鼠髁突軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)逡逑ｖ邐，逡逑ｇ邋．逡逑’邋．ｓ邋二邋■逡逑ｒ邐各？％：邐：邐Ｖ邋‘邋１０0Ｘ邐２００Ｘ逡逑Ｅ邐Ｆ逡逑圖１－２大鼠髁突軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染

圖１－１大鼠髁突軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)逡逑ｖ邐，，逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R782.6

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本文編號：2602960