發(fā)布時間：2020-03-27 05:56

【摘要】： 目的:牙周炎是一種以牙周結(jié)締組織的破壞降解為特征的細菌感染性疾病,其重要的病理過程為牙周細胞外基質(zhì)(ECM)的降解、牙槽骨吸收、牙周袋形成,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在這一過程中發(fā)揮著重要作用。內(nèi)毒素(LPS)作為牙周致病菌的主要毒力因子,可激活牙周組織中的主體細胞-牙齦成纖維細胞(HGFs)合成、分泌各種細胞因子及炎癥介質(zhì),參與牙周組織破壞。本實驗旨在探討一定濃度的內(nèi)毒素對體外培養(yǎng)的牙齦成纖維細胞(HGFs)在不同時間段分泌基質(zhì)金屬蛋白酶量的影響,同時觀察不同濃度的內(nèi)毒素(LPS)對體外培養(yǎng)的牙齦成纖維細胞(HGFs)在生長、增殖活性方面的影響,從而以細胞分泌的角度為出發(fā)點探討基質(zhì)金屬蛋白酶在牙周炎致病機制中的作用,以期為牙周炎的治療提供新的思路。 方法: 1于臨床取得正常牙齦組織,采用傳統(tǒng)組織塊貼壁和改良消化+組織塊法兩種方法進行人牙齦成纖維細胞的原代培養(yǎng),運用第三代細胞進行細胞免疫組織化學(xué)染色,通過波形絲蛋白和角蛋白染色鑒定細胞來源,通過四唑鹽比色法(Methylthiazoletrazolium, MTT)繪制牙齦成纖維細胞的正常生長曲線。 2取生長良好的第四代細胞制成4×104/ml的單細胞懸液,每孔200ul均勻接種于96孔板,用不同濃度的內(nèi)毒素(0.1ug/ml,1ug/ml,10ug/ml,100ug/ml LPS)刺激牙齦成纖維細胞,運用MTT比色檢測牙齦成纖維細胞在不同濃度內(nèi)毒素刺激下的相對增殖率和生長抑制率,從而觀察內(nèi)毒素對牙齦成纖維細胞在生長及增殖活性方面的影響。 3 24孔板內(nèi)以每孔2×10~4的細胞密度將第四代牙齦成纖維細胞接種于蓋玻片上,24h細胞貼壁后棄原培養(yǎng)液用2% DMEM培養(yǎng)液靜息24h,實驗組換含10ug/ml LPS的2% DMEM培養(yǎng),對照組則不加內(nèi)毒素刺激只用2% DMEM培養(yǎng),然后分別在不同的時間段(0h、4h、8h、12h、24h)收集牙齦成纖維細胞的細胞爬片,冰丙酮固定,運用細胞免疫組織化學(xué)染色方法SP法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶1和3(MMP-1, 3)在HGFs中表達的量,從而觀察內(nèi)毒素對牙齦成纖維細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶的影響。 結(jié)果: 1細胞免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:體外培養(yǎng)的牙齦成纖維細胞均為抗波形絲蛋白染色陽性,陽性部位位于胞漿;抗角蛋白陰性,證實細胞來源于中胚層,符合牙齦成纖維細胞的生物學(xué)特征。 第四代牙齦成纖維細胞運用MTT法繪制生長曲線結(jié)果顯示:牙齦成纖維細胞的生長曲線呈典型的“S”形,經(jīng)歷了潛伏期、對數(shù)生長期和平臺期三個生長階段。 2不同濃度內(nèi)毒素刺激牙齦成纖維細胞MTT結(jié)果顯示: 與陰性對照組相比,第一天0.1ug/ml組(A)、1ug/ml組(B)、10ug/ml組(C)、100ug/ml組(D)HGF的相對增殖率分別為150±4.18%,127.06±4.23%,100.44±3.78%,72.94±4.42%,A、B、D組與對照組之間有顯著性差異(P0.05),C組與對照組之間無顯著性差異(P0.05),A、B、C與D組比較均有顯著性差異(P0.05),A、B之間無顯著差異(P0.05),A、C,B、C之間均有顯著性差異(P0.05)。 第二天結(jié)果顯示:A、B、C、D組的相對增殖率分別為143.27±3.28% , 112.67±4.06% , 81.12±4.13% ,61.45±4.36%,四組與對照組之間均有顯著性差異(P0.05),A、B,A、B與C,A、B與D之間均有顯著性差異(P0.05)。 第一天與第二天同一濃度相比較,A、B、D組無顯著性差異(P0.05),C組有顯著性差異(P0.05)。 第四天、第六天、第七天結(jié)果顯示四組增殖率均逐漸降低且呈濃度依賴關(guān)系,即內(nèi)毒素濃度越大,HGF增殖率越低,低濃度組隨著時間的延長,也由對HGF的刺激生長轉(zhuǎn)為抑制,但各濃度組HGF的生長趨勢與陰性對照組大致相似。 3細胞免疫組織化學(xué)方法檢測牙齦成纖維細胞在內(nèi)毒素刺激下不同時間段MMP-1、MMP-3表達量的結(jié)果顯示:MMP-1抗體主要在牙齦成纖維細胞的胞漿表達,在0h,4h,8h,12h的組化評分分別為0.006,0.35,1.14,2.28,表達趨勢逐漸增強,在12h時達到頂峰,以后表達逐漸減弱,24h的組化評分為0.12。 MMP-3抗體表達部位與MMP-1類似,也主要在牙齦成纖維細胞的胞漿表達,在0h,4h,8h,12h,24h的組化評分分別為0.002,0.29,1.10,2.13,0.007,可見表達趨勢與MMP-1基本類似,在0h-12h之間表達趨勢逐漸增強,12h時達到頂峰,以后表達量逐漸減弱,但在同一時間段內(nèi)MMP-3的表達較MMP-1弱,因而就總體來說,MMP-3表達量較MMP-1少。 結(jié)論: 1體外成功培養(yǎng)了人牙齦成纖維細胞,采用改良酶消化+組織塊法進行牙齦成纖維細胞的原代培養(yǎng)與傳統(tǒng)的單純組織塊法培養(yǎng)技術(shù)相比其成功率顯著提高。 2內(nèi)毒素可影響牙齦成纖維細胞的增殖活性:低濃度時可促進其增殖,而高濃度組則對其有毒性作用,抑制其增殖,且隨著時間延長抑制率越來越高,此外低濃度組隨著時間的延長也對其表現(xiàn)出細胞毒性作用,抑制其生長。 3牙齦成纖維細胞在正常情況下可表達少量的MMP-1, 3,受內(nèi)毒素刺激后表達基質(zhì)金屬蛋白酶-1, 3的量顯著增多,其表達趨勢基本一致,在12h內(nèi)逐漸增多,至12h時達到頂峰,后逐漸減弱,但MMP-3的整體表達較MMP-1弱。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R781.4

【參考文獻】

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本文編號：2602564