【摘要】：背景與目的:牙周病是常見(jiàn)的口腔疾病,是引起成年人牙齒喪失的主要原因之一,但卻往往被人們所忽視。牙周病的致病因素有很多,其中最主要的致病因素是菌斑生物膜,是由菌斑的細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物作用于牙周組織從而激活宿主炎癥免疫反應(yīng)導(dǎo)致牙周組織破壞的一種炎癥性疾病。當(dāng)人牙周膜細(xì)胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)受到致病菌及其代謝產(chǎn)物刺激時(shí),hPDLCs自身可分泌多種細(xì)胞因子和化學(xué)介質(zhì)參與局部免疫反應(yīng)。脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)是公認(rèn)的炎癥啟動(dòng)因子,可通過(guò)刺激免疫細(xì)胞和局部鄰近組織細(xì)胞增加炎癥因子的表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)宿主發(fā)生一系列免疫反應(yīng)。白介素-6(Interleukin-6,IL-6)與炎癥、自身免疫疾病等密切相關(guān),炎癥免疫反應(yīng)發(fā)生后,IL-6率先生成,參與牙周組織慢性炎癥過(guò)程。白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)又稱為趨化因子CXCL-8,是趨化因子家族的一種細(xì)胞因子。IL-8結(jié)合受體α(CXCR-1)和受體β(CXCR-2)通過(guò)趨化、聚集并激活中性粒細(xì)胞,發(fā)生脫顆粒作用釋放溶酶體酶促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放,而實(shí)現(xiàn)其對(duì)炎癥免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié),達(dá)到殺菌和細(xì)胞損傷的目的。TLR-2(Toll-like receptor-2,TLR-2)、TLR-4(Toll-like receptor-4,TLR-4)是I型跨膜蛋白,屬于模式識(shí)別受體,它們都在LPS激發(fā)的炎癥免疫反應(yīng)中起重要作用,是細(xì)菌破壞細(xì)胞的關(guān)鍵途徑。當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí),局部炎癥組織及細(xì)胞處于乏氧微環(huán)境中,因此在乏氧微環(huán)境下對(duì)牙周炎癥的研究更接近牙周炎時(shí)真實(shí)的牙周組織微環(huán)境。目前,國(guó)內(nèi)外關(guān)于乏氧和LPS分別對(duì)hPDLCs的影響的研究已經(jīng)比較廣泛和深入,但乏氧條件下研究LPS對(duì)hPDLCs免疫反應(yīng)的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在乏氧環(huán)境下培養(yǎng)經(jīng)LPS誘導(dǎo)的hPDLCs,模擬真實(shí)情況下牙周炎癥組織局部乏氧的病理模型,通過(guò)檢測(cè)IL-6、IL-8、TLR-2、TLR-4的表達(dá)情況分析乏氧對(duì)LPS誘導(dǎo)的hPDLCs炎癥免疫反應(yīng)的影響,以期為牙周病的治療提供新思路。材料和方法:1、組織塊法原代培養(yǎng)hPDLCs;2、取第4代hPDLCs,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞分子表型對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定;3、取第3代hPDLCs,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況;4、模型建立及實(shí)驗(yàn)分組:取第4代生長(zhǎng)良好的hPDLCs隨機(jī)分為4組:(A組)常氧+無(wú)LPS、(B組)常氧+LPS、(C組)乏氧+無(wú)LPS、(D組)乏氧+LPS。培養(yǎng)6h、12h、24h、48h后收集各組細(xì)胞,分別用Realtime-PCR檢測(cè)IL-6、IL-8、TLR-2、TLR-4mRNA的表達(dá);5、模型建立及實(shí)驗(yàn)分組:取第4代生長(zhǎng)良好的hPDLCs隨機(jī)分為4組:(A組)常氧+無(wú)LPS、(B組)常氧+LPS、(C組)乏氧+無(wú)LPS、(D組)乏氧+LPS。培養(yǎng)6h、12h、24h、48h后收集各組細(xì)胞及其上清液,分別用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-Linked-Immunosorbent Assay,ELISA)檢測(cè)各組IL-6、IL-8的表達(dá)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組TLR-2、TLR-4的表達(dá)。結(jié)果:1、組織塊法體外培養(yǎng)成功獲得hPDLCs;2、流式結(jié)果示:所培養(yǎng)細(xì)胞為間充質(zhì)來(lái)源,符合成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性;3、CCK-8結(jié)果示:細(xì)胞生長(zhǎng)呈“S”形,符合成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律;4、Realtime-PCR結(jié)果從基因水平上說(shuō)明:與對(duì)照組相比,乏氧(1%02)或LPS刺激對(duì)hPDLCs炎癥因子IL-6、IL-8、TLR-2、TLR-4mRNA的表達(dá)有顯著促進(jìn)作用,且乏氧(1%02)能增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的IL-6、IL-8、TLR-2、TLR-4 mRNA的表達(dá);5、ELISA和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果從蛋白水平上說(shuō)明:與對(duì)照組相比,乏氧(1%02)或LPS刺激對(duì)hPDLCs炎癥因子IL-6、IL-8、TLR-2、TLR-4的蛋白表達(dá)有顯著促進(jìn)作用,且乏氧(1%O2)能增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的IL-6、IL-8、TLR-2、TLR-4的蛋白表達(dá)。結(jié)論:1、乏氧及脂多糖均可誘導(dǎo)hPDLCs炎癥因子的表達(dá)。2、乏氧可增強(qiáng)脂多糖誘導(dǎo)的hPDLCs炎癥因子表達(dá)。
【圖文】：

、原代ｈＰＤＬＣｓ的形態(tài)學(xué)觀察逡逑組織塊法培養(yǎng)５ｄ后，，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)部分組織塊周圍有細(xì)胞游出，細(xì)胞貼壁逡逑生長(zhǎng)（圖１Ａ）；組織塊法培養(yǎng)１０ｄ后，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)部分組織塊周圍發(fā)亮，以逡逑組織塊為中心，細(xì)胞游出并呈放射狀或漩渦狀排列生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)多呈梭形，細(xì)逡逑胞核呈圓形或卵圓形位于細(xì)胞中央，為成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞（圖１Ｂ）；組織塊法逡逑培養(yǎng)１４ｄ后，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)部分組織塊崩解，細(xì)胞多呈放射狀或漩渦狀排列（圖逡逑１Ｃ）；傳代培養(yǎng)后，ｈＰＤＬＣｓ生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定、良好（圖１Ｄ）。逡逑Ｍ邋■邐▲．．逡逑Ｃ邐＿邋Ｄ邐＿逡逑ａ＊ｔｉｍ邐ｍｔ０？逡逑圖１組織塊法培養(yǎng)ｈＰＤＬＣｓ逡逑（Ａ）培養(yǎng)邋５ｄ邋的邋ｈＰＤＬＣｓ；邋（Ｂ）培養(yǎng)邋ｌＯｄ邋的邋ｈＰＤＬＣｓ；逡逑（Ｃ）培養(yǎng)１４ｄ的ｈＰＤＬＣｓ；邋（Ｄ）傳代培養(yǎng)后的ｈＰＤＬＣｓ。逡逑二、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞分子表型逡逑流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所培養(yǎng)的ｈＰＤＬＣｓ，邋ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０抗體標(biāo)記的陽(yáng)性逡逑細(xì)胞率分別為邋９８．４％、９７．８％、９６．８％邋（圖邋２Ａ，圖邋２Ｂ，圖邋２Ｃ），ＣＤ３１、ＣＤ３４、逡逑ＣＤ４５抗體標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞率分別為０．４％、０．２％、０．５％邋（圖２Ｄ，圖２Ｅ，圖２Ｆ），逡逑說(shuō)明此細(xì)胞為間充質(zhì)來(lái)源

細(xì)胞生長(zhǎng)呈“Ｓ”形，接種后第１天細(xì)胞開(kāi)始增殖但速度較慢，第３？６天細(xì)胞逡逑快速增殖，第７天開(kāi)始細(xì)胞增殖減緩，在第９天達(dá)到生長(zhǎng)最高峰，之后細(xì)胞數(shù)量逡逑開(kāi)始減少，符合成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律（圖３）。逡逑０－１邐１邐１邐１逡逑０邐５邐１０邐１５逡逑Ｔｉｍｅ邋（ｄ）逡逑圖３邋ＣＣＫ－８法檢測(cè)ｈＰＤＬＣｓ增值曲線逡逑２２逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R781.4

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5 黃華t

本文編號(hào)：2602266