【摘要】： 第一部分應力作用對大鼠滑膜細胞形態(tài)學的影響 顳下頜關節(jié)(temporomandibular joint,TMJ)是人體內保持較強終身改建能力的負重關節(jié)。顳下頜關節(jié)紊亂病(temporomandibular disorders,TMD)是口腔外科臨床的常見病,關節(jié)盤前移位(anterior disc displacement,ADD)是其中最常見的類型。因為局部力學環(huán)境的改變,關節(jié)盤移位后,作為關節(jié)運動的兩個主要承力區(qū)的髁突和關節(jié)盤可以發(fā)生一系列的適應性改建以適應新的盤突關系。并且滑膜的過量炎癥反應被認為是TMD的起始因素之一。然而,臨床研究發(fā)現一些有癥狀的關節(jié)盤移位患者在不恢復關節(jié)盤正常解剖位置的情況下進行保守治療亦可達良好的療效。生物力對影響骨關節(jié)形態(tài)、功能以及軟骨生成的重要因素之一。但目前生物力學研究多集中在大骨關節(jié)上,對于TMJ盤移位后髁突以及雙板區(qū)的力學研究較少。 實驗一無菌條件下取Sprague-Dawley大鼠雙側TMJ髁突關節(jié)盤后區(qū)平滑光亮的滑膜組織,用組織塊法處理滑膜組織,將培養(yǎng)瓶倒置37℃,5%CO_2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2-3 hrs,使其貼壁。然后翻轉繼續(xù)培養(yǎng)。待有滑膜細胞爬出組織塊后,去除組織塊,繼續(xù)培養(yǎng)。3d后可見有梭形細胞貼壁生長。為鑒定分離得到的原代滑膜細胞,分別用巨噬細胞標記物CD68和纖維原細胞標記物vimentin對培養(yǎng)的細胞進行免疫染色。同時設計加載應力模式為靜水壓力(hydrostatic pressure,HP)0kPa,30kPa,60kPa和90kPa 12 hrs。 結果顯示:培養(yǎng)的滑膜細胞貼壁生長,分布均勻,形態(tài)均一,呈短梭狀,有兩個或多個突起,細胞核呈卵圓性,位于細胞中央,核仁明顯。培養(yǎng)的原代細胞達鋪滿狀態(tài)所需的時間,與分離細胞的存活率和細胞接種密度等有關系,存活率越高,接種密度越大,到達鋪滿狀態(tài)所需的時間越短。所有培養(yǎng)的滑膜細胞均對vimentin蛋白表達陽性,CD68蛋白表達陰性,說明該細胞來源于中胚層,并具有成纖維細胞的特點,是滑膜細胞B型細胞,即滑膜成纖維細胞(synovial fibroblasts,SFs)。 實驗二分別用MTT法、流式細胞術、超微電鏡、免疫染色等方法來檢測不同程度的HP對SFs增殖、細胞周期、超微結構以及細胞骨架的影響。 結果顯示:MTT結果顯示受到不同HP的各組SFs增殖率間不存在顯著差異。運用流式細胞術分析細胞周期所得的結果也表明應力組和正常組細胞G2期與G1期細胞數目大致相同。而在不同強度的HP下SFs的F-actin呈現較為不同的變化。正常情況下,F-actin在細胞間呈現大量有序排列的突起,在應力情況下,細胞外形被拉伸,呈現較強的應力纖維染色特征。 不同HP下SFs的超微結構也呈現不同程度的改變。30kPa應力下細胞胞漿和胞核輕度皺縮,在致密的胞漿中可以辨認線粒體等細胞器,核仁明顯,較0kPa時變化不大;60kPa作用后發(fā)現胞體進一步皺縮,胞膜及其內側空泡形成,胞核更加致密,但仍可見完整的核膜結構及邊聚的染色質,呈新月形或駝峰狀;90kPa時SFs的超微結構主要表現為核膜結構不完整,細胞器變性,核內結構少量溶解;胞漿內空泡形成,染色質凝集成塊,與核膜分離,殘留網狀或顆粒狀的染色。 當TMJ髁突受到機械負重,關節(jié)腔內的應力就會改變。HP就作為一個機械因素,來維持關節(jié)腔的穩(wěn)定性,并且高的HP能夠影響細胞結構和細胞分化,干擾細胞膜的流動性和細胞膜的結構以及一些內部的細胞器。SFs作為近些年來對關節(jié)組織的研究靶點,能夠對機械的、離子的和滲透性的信號有較好的敏感性和傳導性;并根據周圍環(huán)境、激素和基因等因素對所收到的信號做出相應的反饋,進而調節(jié)代謝活動。 第二部分應力對滑膜細胞TGF-β、BMP-2和SOX-9表達的影響 迄今為止,應力作用下TMJ軟骨重建的機制還未能完全闡明。眾多研究表明,雙板區(qū)滑膜組織內壓力的提高主要是由關節(jié)盤移位造成,可能引起雙板區(qū)軟骨化生過程和關節(jié)的重建。轉化生長因子-beta(transforming growth factor beta,TGF-β)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)在骨及軟骨的修復,成骨細胞和破骨細胞的分化、增殖過程中都發(fā)揮著極其重要的作用:同時TGF-β與BMP-2與其各自的受體結合后能通過細胞內信號系統(tǒng)將信號傳遞到細胞核內而起到多種不同的生理調節(jié)作用。SOX-9基因則是軟骨化生的重要指標之一。上一章研究已發(fā)現應力作用下,SFs的細胞骨架會發(fā)生一定的變化,但應力對SFs生長相關蛋白表達的研究還較少。因此我們通過觀察SFs在不同HP作用下TGF-β、BMP-2和SOX-9的表達情況,對應力作用下TMJ的改建機理進行探討 實驗三SFs原代培養(yǎng)和應力加載方式同第一部分實驗一。分別用免疫細胞化學和Western Blot法檢測不同強度HP作用下的SFs中TGF-β、BMP-2和SOX-9表達情況。對免疫細胞化學結果進行灰度測定,用t檢驗和單因素方差分析對灰度值進行統(tǒng)計學分析。Western Blot結果用Biosense 300 software軟件進行信號分析,以GAPDH蛋白的光密度值進行標準校正,計算TGF-β、BMP-2和SOX-9蛋白產物的相對量。 結果顯示:TGF-β和BMP-2在正常細胞表達不高,在HP作用下表達明顯增強,但隨著HP強度增高,該變化并不明顯。SOX-9在30kPa時染色高于正常培養(yǎng)的細胞染色,60kPa時表達增加,90kPa時表達又稍有降低。Western Blot結果與免疫細胞化學的結果一致。 關節(jié)負重是維持關節(jié)軟骨正常組成和功能的基本要求。盡管TMD的發(fā)病機理尚不完全清楚,但關節(jié)軟骨承受的局部生物力對于TMD的發(fā)生發(fā)展有潛在的促進作用。關節(jié)盤移位后,髁突在前移位關節(jié)盤的機械刺激下可以發(fā)生一系列的改建。關節(jié)盤移位后,局部滑膜組織增厚,表明局部有炎性刺激,其受到前移位關節(jié)盤的持續(xù)存在的牽拉作用,使得雙板區(qū)應力環(huán)境發(fā)生改變,滑膜組織的代謝加快達到新的平衡。因而我們有理由認為關節(jié)盤移位后TGF-β和BMP-2的表達的升高更多是由于雙板區(qū)組織受到的機械應力刺激的直接結果。SOX-9的表達在軟骨形成早期變化明顯,可以成為TMD發(fā)生發(fā)展過程早期的重要標記。 第三部分應力對滑膜細胞MAPK通路蛋白表達的影響 MAPK信號通路參與多種細胞外刺激引起的細胞反應,在細胞的多項生命活動及對細胞外環(huán)境變化引起的適應性改建中發(fā)揮重要的調控作用。但對于MAPK通路是否在髁突軟骨表達以及在骨組織改建中的作用尚不明確。有實驗發(fā)現在人滑膜組織的纖維位點發(fā)現炎癥細胞浸潤和TGF-β的過表達,TGF-β的過表達不僅會引起組織纖維化的病理過程,還會影響正常器官的功能。本章對SFs在不同程度HP作用下MAPK通路上三個重要蛋白ERK、JNK和p38的表達及其活化情況進行了檢測,初步探討了上述三個通路在異常應力下的作用。并且加入ERK特異阻斷劑PD98059后,觀察不同時間點TGF-β的變化。 實驗四將原代培養(yǎng)的SFs加載應力后,用Western Blot方法對不同HP作用下MAPK通路上三個重要蛋白ERK、JNK和p38在SFs表達及其活化情況進行檢測,初步探討上述三個通路在異常應力下的作用。 結果顯示:與正常細胞相比,30 kPa HP作用顯著抑制了ERK蛋白表達,60 kPa時恢復到正常組水平,但90 kPa時又有所降低;而ERK的活化水平在30 kPa時最高,在90 kPa時最低;30 kPa應力作用同時也提高了JNK蛋白的表達,在60 kPa和90 kPa時,JNK的表達依次明顯降低;而應力作用對p38的表達以及JNK、p38的磷酸化水平基本無影響。 實驗五在原代培養(yǎng)的SFs中加入15μM PD 98059在30kPa HP作用下分別培養(yǎng)5 mins,30 mins,1 hr,2 hrs,4 hrs,8 hrs和12 hrs,以同等應力同等時間點未加入PD 98059收集的細胞作對照。ERK的阻斷劑PD98059按照說明書用DMSO溶解,對照組細胞在加載應力前用PD98059孵育1 hr�？瞻捉M細胞用0.04%的DMSO孵育。收集細胞培養(yǎng)液并ELISA試劑盒檢測在加載應力前加入ERK阻斷劑PD98059探討在ERK/MAPK通路調節(jié)應力下TGF-β的作用。 結果顯示:SFs在應力作用下TGF-β的分泌量增加,尤其在30kPa作用下分泌量增加較多,而在加入ERK特異抑制劑PD98059后,TGF-β的活性得到了顯著抑制。提示在一定的應力作用下SFs可通過提高TGF-β的活性,導致MAPK通路的激活,從而啟動自適應性改建過程。 本部分內容側重分析了SFs在HP作用下三種MAPK亞型,ERK,JNK和p38的表達和活化情況。ERK通路在HP作用下起著重要的調節(jié)作用,JNK和p38作用不明顯。在30kPaHP作用下加入ERK通路抑制劑PD98059后,SFs分泌TGF-β的活性得到了顯著抑制。進一步證明TGF-β介導的ERK通路在SFs受到應力作用下引發(fā)的自我適應和調節(jié)的過程中起著一定作用。而p38和ERK在成骨過程中起著相反的調節(jié)作用,分化活性通過介導黏附分子的表達在前軟骨階段的后期來調節(jié)成骨,在本試驗中p38的作用較小。 第四部分丹皮中具有滑膜細胞保護作用的化合物篩選 滑膜的過量炎癥反應被認為是TMD的起始因素之一。SFs在應力作用下會加大TNF-α等炎癥因子的分泌量,以啟動后續(xù)的病理生理過程。因此可推測,具有抗炎活性的化合物可用于治療早期的TMD。中藥在治療復雜性疾病、慢性疾病、免疫疾病等方面具有獨特的療效和優(yōu)勢。丹皮提取物能夠抑制ROS堆積,并具有自由基清除能力,另一種與丹皮具有類似化學組成的中藥材—芍藥的提取物,能夠在抑制關節(jié)炎大鼠的炎癥反應,并改變SFs的超微結構。然而,丹皮藥材中具有抗炎活性的化合物及其活性,至今少見報道。本部分內容通過活性追蹤的方式篩選并鑒定有效成分,確定丹皮提取物及組分的抗炎活性。 實驗六運用制備液相色譜分離丹皮提取物得到22個組分,采用實驗一介紹的原代培養(yǎng)SFs,加入10 ng/mL的IL-1β刺激后,ELISA法檢測培養(yǎng)液中TNF-α含量。并運用液相色譜—質譜聯(lián)用法對具有活性的組分進行鑒定并分離。 結果顯示:分離得到的6個組分能夠顯著抑制IL-1β刺激后的SFs分泌TNF-α。通過對活性組分的鑒定從中發(fā)現8種化學成分。進一步研究分離得到的三種化學成分芍藥苷、丹皮酚和五沒食子酰葡萄糖對于抑制SFs合成TNF-α和IL-6時均呈現明顯的量效關系。 近年來,大量臨床和實驗研究表明許多中藥提取物和中藥活性成分是一類安全、有效的骨關節(jié)炎和風濕性關節(jié)炎治療藥物。研究者通過比較姜黃科的中藥材在關節(jié)炎小鼠模型上的抗炎活性,找出了一系列有活性的中藥提取物。由此可見,有望從中藥提取物中找出治療TMD的藥物。以往,TMD常采用保守治療,也有研究者嘗試采用關節(jié)內注射超氧化物岐化酶和透明質酸鈉的方法進行補充治療。本部分研究結果表明,丹皮提取物中的一些具有抗炎活性的有效化合物通過控制TMD患者的炎癥反應來達到預防和治療的目的。 結論 1.滑膜細胞在應力作用下形態(tài)學和超微結構會發(fā)生變化,且這種變化程度與應力大小有關。 2.靜水壓力能夠引起滑膜細胞骨形成相關蛋白的變化,這種改變與力學的大小呈現不同趨勢的變化,說明TGF-β、BMP-2和SOX-9對于滑膜細胞在應力作用下起到不同的調節(jié)作用。 3.靜水壓力能引起MAPK通路上ERK、JNK、P38等重要信號分子的改變并引起ERK的活化,提示ERK1/2通路的作用發(fā)揮著重要作用。并且TGF-β介導的ERK通路在滑膜細胞應力作用下的自我適應和調節(jié)過程中起著信號傳導的作用。 4.從丹皮藥材中純化得到的三種活性化合物芍藥苷、丹皮酚和五沒食子酰葡萄糖能夠抑制顳下頜關節(jié)滑膜細胞的炎癥反應。
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1.3.1加力裝置及應力范圍加力裝置設計參考Ozawa介紹的加力裝置，，并作了相應的改良簡化117]。應力裝置由四川空氣分離設備制造有限公司制造，裝置示意圖如圖1一3(A)所示。裝置實圖如圖1一2(B)所示，罐體是不銹鋼，連接壓力表，并經過 24hLrS密封測試。將預先合成的混合氣體(02:NZ:CO:=7.0%:91.3%:1.7%)充入壓力罐，根據壓力表指示調整至實驗需要的壓力。細胞培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)皿中，置于壓力罐內，然后將壓力罐置于細胞培養(yǎng)箱中，保持溫度37℃。相對濕度>90%。 12hrs后收集細胞備用。本實驗加載應力模式為靜水壓力(hydrostaticpressure，Hp)0沙a， 30kPa， 60kPa和 90kPa加載 12hrs。獷獷節(jié)二詳可 可炸炸壇任找 找卜 卜。。二。.;;; ...二

94.4%士5.6(n=4)。盡管從數據上發(fā)現應力作用能輕微地抑制于s增殖，但統(tǒng)計檢驗表明，各組間不存在顯著差異。運用流式細胞術分析細胞周期，結果也表明應力組和正常組細胞G2期與Gl期細胞數目大致相同(圖14B)。因此，在本實驗所采用的應力范圍內，汗s生長基本不受影響。B知.二右Z:.口

本文編號：2600191