【摘要】： 第一部分應(yīng)力作用對(duì)大鼠滑膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 顳下頜關(guān)節(jié)(temporomandibular joint,TMJ)是人體內(nèi)保持較強(qiáng)終身改建能力的負(fù)重關(guān)節(jié)。顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病(temporomandibular disorders,TMD)是口腔外科臨床的常見病,關(guān)節(jié)盤前移位(anterior disc displacement,ADD)是其中最常見的類型。因?yàn)榫植苛W(xué)環(huán)境的改變,關(guān)節(jié)盤移位后,作為關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)的兩個(gè)主要承力區(qū)的髁突和關(guān)節(jié)盤可以發(fā)生一系列的適應(yīng)性改建以適應(yīng)新的盤突關(guān)系。并且滑膜的過(guò)量炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是TMD的起始因素之一。然而,臨床研究發(fā)現(xiàn)一些有癥狀的關(guān)節(jié)盤移位患者在不恢復(fù)關(guān)節(jié)盤正常解剖位置的情況下進(jìn)行保守治療亦可達(dá)良好的療效。生物力對(duì)影響骨關(guān)節(jié)形態(tài)、功能以及軟骨生成的重要因素之一。但目前生物力學(xué)研究多集中在大骨關(guān)節(jié)上,對(duì)于TMJ盤移位后髁突以及雙板區(qū)的力學(xué)研究較少。 實(shí)驗(yàn)一無(wú)菌條件下取Sprague-Dawley大鼠雙側(cè)TMJ髁突關(guān)節(jié)盤后區(qū)平滑光亮的滑膜組織,用組織塊法處理滑膜組織,將培養(yǎng)瓶倒置37℃,5%CO_2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3 hrs,使其貼壁。然后翻轉(zhuǎn)繼續(xù)培養(yǎng)。待有滑膜細(xì)胞爬出組織塊后,去除組織塊,繼續(xù)培養(yǎng)。3d后可見有梭形細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。為鑒定分離得到的原代滑膜細(xì)胞,分別用巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD68和纖維原細(xì)胞標(biāo)記物vimentin對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行免疫染色。同時(shí)設(shè)計(jì)加載應(yīng)力模式為靜水壓力(hydrostatic pressure,HP)0kPa,30kPa,60kPa和90kPa 12 hrs。 結(jié)果顯示:培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),分布均勻,形態(tài)均一,呈短梭狀,有兩個(gè)或多個(gè)突起,細(xì)胞核呈卵圓性,位于細(xì)胞中央,核仁明顯。培養(yǎng)的原代細(xì)胞達(dá)鋪滿狀態(tài)所需的時(shí)間,與分離細(xì)胞的存活率和細(xì)胞接種密度等有關(guān)系,存活率越高,接種密度越大,到達(dá)鋪滿狀態(tài)所需的時(shí)間越短。所有培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞均對(duì)vimentin蛋白表達(dá)陽(yáng)性,CD68蛋白表達(dá)陰性,說(shuō)明該細(xì)胞來(lái)源于中胚層,并具有成纖維細(xì)胞的特點(diǎn),是滑膜細(xì)胞B型細(xì)胞,即滑膜成纖維細(xì)胞(synovial fibroblasts,SFs)。 實(shí)驗(yàn)二分別用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、超微電鏡、免疫染色等方法來(lái)檢測(cè)不同程度的HP對(duì)SFs增殖、細(xì)胞周期、超微結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞骨架的影響。 結(jié)果顯示:MTT結(jié)果顯示受到不同HP的各組SFs增殖率間不存在顯著差異。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期所得的結(jié)果也表明應(yīng)力組和正常組細(xì)胞G2期與G1期細(xì)胞數(shù)目大致相同。而在不同強(qiáng)度的HP下SFs的F-actin呈現(xiàn)較為不同的變化。正常情況下,F-actin在細(xì)胞間呈現(xiàn)大量有序排列的突起,在應(yīng)力情況下,細(xì)胞外形被拉伸,呈現(xiàn)較強(qiáng)的應(yīng)力纖維染色特征。 不同HP下SFs的超微結(jié)構(gòu)也呈現(xiàn)不同程度的改變。30kPa應(yīng)力下細(xì)胞胞漿和胞核輕度皺縮,在致密的胞漿中可以辨認(rèn)線粒體等細(xì)胞器,核仁明顯,較0kPa時(shí)變化不大;60kPa作用后發(fā)現(xiàn)胞體進(jìn)一步皺縮,胞膜及其內(nèi)側(cè)空泡形成,胞核更加致密,但仍可見完整的核膜結(jié)構(gòu)及邊聚的染色質(zhì),呈新月形或駝峰狀;90kPa時(shí)SFs的超微結(jié)構(gòu)主要表現(xiàn)為核膜結(jié)構(gòu)不完整,細(xì)胞器變性,核內(nèi)結(jié)構(gòu)少量溶解;胞漿內(nèi)空泡形成,染色質(zhì)凝集成塊,與核膜分離,殘留網(wǎng)狀或顆粒狀的染色。 當(dāng)TMJ髁突受到機(jī)械負(fù)重,關(guān)節(jié)腔內(nèi)的應(yīng)力就會(huì)改變。HP就作為一個(gè)機(jī)械因素,來(lái)維持關(guān)節(jié)腔的穩(wěn)定性,并且高的HP能夠影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞分化,干擾細(xì)胞膜的流動(dòng)性和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)以及一些內(nèi)部的細(xì)胞器。SFs作為近些年來(lái)對(duì)關(guān)節(jié)組織的研究靶點(diǎn),能夠?qū)C(jī)械的、離子的和滲透性的信號(hào)有較好的敏感性和傳導(dǎo)性;并根據(jù)周圍環(huán)境、激素和基因等因素對(duì)所收到的信號(hào)做出相應(yīng)的反饋,進(jìn)而調(diào)節(jié)代謝活動(dòng)。 第二部分應(yīng)力對(duì)滑膜細(xì)胞TGF-β、BMP-2和SOX-9表達(dá)的影響 迄今為止,應(yīng)力作用下TMJ軟骨重建的機(jī)制還未能完全闡明。眾多研究表明,雙板區(qū)滑膜組織內(nèi)壓力的提高主要是由關(guān)節(jié)盤移位造成,可能引起雙板區(qū)軟骨化生過(guò)程和關(guān)節(jié)的重建。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-beta(transforming growth factor beta,TGF-β)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)在骨及軟骨的修復(fù),成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化、增殖過(guò)程中都發(fā)揮著極其重要的作用:同時(shí)TGF-β與BMP-2與其各自的受體結(jié)合后能通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)系統(tǒng)將信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)而起到多種不同的生理調(diào)節(jié)作用。SOX-9基因則是軟骨化生的重要指標(biāo)之一。上一章研究已發(fā)現(xiàn)應(yīng)力作用下,SFs的細(xì)胞骨架會(huì)發(fā)生一定的變化,但應(yīng)力對(duì)SFs生長(zhǎng)相關(guān)蛋白表達(dá)的研究還較少。因此我們通過(guò)觀察SFs在不同HP作用下TGF-β、BMP-2和SOX-9的表達(dá)情況,對(duì)應(yīng)力作用下TMJ的改建機(jī)理進(jìn)行探討 實(shí)驗(yàn)三SFs原代培養(yǎng)和應(yīng)力加載方式同第一部分實(shí)驗(yàn)一。分別用免疫細(xì)胞化學(xué)和Western Blot法檢測(cè)不同強(qiáng)度HP作用下的SFs中TGF-β、BMP-2和SOX-9表達(dá)情況。對(duì)免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果進(jìn)行灰度測(cè)定,用t檢驗(yàn)和單因素方差分析對(duì)灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Western Blot結(jié)果用Biosense 300 software軟件進(jìn)行信號(hào)分析,以GAPDH蛋白的光密度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正,計(jì)算TGF-β、BMP-2和SOX-9蛋白產(chǎn)物的相對(duì)量。 結(jié)果顯示:TGF-β和BMP-2在正常細(xì)胞表達(dá)不高,在HP作用下表達(dá)明顯增強(qiáng),但隨著HP強(qiáng)度增高,該變化并不明顯。SOX-9在30kPa時(shí)染色高于正常培養(yǎng)的細(xì)胞染色,60kPa時(shí)表達(dá)增加,90kPa時(shí)表達(dá)又稍有降低。Western Blot結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果一致。 關(guān)節(jié)負(fù)重是維持關(guān)節(jié)軟骨正常組成和功能的基本要求。盡管TMD的發(fā)病機(jī)理尚不完全清楚,但關(guān)節(jié)軟骨承受的局部生物力對(duì)于TMD的發(fā)生發(fā)展有潛在的促進(jìn)作用。關(guān)節(jié)盤移位后,髁突在前移位關(guān)節(jié)盤的機(jī)械刺激下可以發(fā)生一系列的改建。關(guān)節(jié)盤移位后,局部滑膜組織增厚,表明局部有炎性刺激,其受到前移位關(guān)節(jié)盤的持續(xù)存在的牽拉作用,使得雙板區(qū)應(yīng)力環(huán)境發(fā)生改變,滑膜組織的代謝加快達(dá)到新的平衡。因而我們有理由認(rèn)為關(guān)節(jié)盤移位后TGF-β和BMP-2的表達(dá)的升高更多是由于雙板區(qū)組織受到的機(jī)械應(yīng)力刺激的直接結(jié)果。SOX-9的表達(dá)在軟骨形成早期變化明顯,可以成為TMD發(fā)生發(fā)展過(guò)程早期的重要標(biāo)記。 第三部分應(yīng)力對(duì)滑膜細(xì)胞MAPK通路蛋白表達(dá)的影響 MAPK信號(hào)通路參與多種細(xì)胞外刺激引起的細(xì)胞反應(yīng),在細(xì)胞的多項(xiàng)生命活動(dòng)及對(duì)細(xì)胞外環(huán)境變化引起的適應(yīng)性改建中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。但對(duì)于MAPK通路是否在髁突軟骨表達(dá)以及在骨組織改建中的作用尚不明確。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在人滑膜組織的纖維位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和TGF-β的過(guò)表達(dá),TGF-β的過(guò)表達(dá)不僅會(huì)引起組織纖維化的病理過(guò)程,還會(huì)影響正常器官的功能。本章對(duì)SFs在不同程度HP作用下MAPK通路上三個(gè)重要蛋白ERK、JNK和p38的表達(dá)及其活化情況進(jìn)行了檢測(cè),初步探討了上述三個(gè)通路在異常應(yīng)力下的作用。并且加入ERK特異阻斷劑PD98059后,觀察不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β的變化。 實(shí)驗(yàn)四將原代培養(yǎng)的SFs加載應(yīng)力后,用Western Blot方法對(duì)不同HP作用下MAPK通路上三個(gè)重要蛋白ERK、JNK和p38在SFs表達(dá)及其活化情況進(jìn)行檢測(cè),初步探討上述三個(gè)通路在異常應(yīng)力下的作用。 結(jié)果顯示:與正常細(xì)胞相比,30 kPa HP作用顯著抑制了ERK蛋白表達(dá),60 kPa時(shí)恢復(fù)到正常組水平,但90 kPa時(shí)又有所降低;而ERK的活化水平在30 kPa時(shí)最高,在90 kPa時(shí)最低;30 kPa應(yīng)力作用同時(shí)也提高了JNK蛋白的表達(dá),在60 kPa和90 kPa時(shí),JNK的表達(dá)依次明顯降低;而應(yīng)力作用對(duì)p38的表達(dá)以及JNK、p38的磷酸化水平基本無(wú)影響。 實(shí)驗(yàn)五在原代培養(yǎng)的SFs中加入15μM PD 98059在30kPa HP作用下分別培養(yǎng)5 mins,30 mins,1 hr,2 hrs,4 hrs,8 hrs和12 hrs,以同等應(yīng)力同等時(shí)間點(diǎn)未加入PD 98059收集的細(xì)胞作對(duì)照。ERK的阻斷劑PD98059按照說(shuō)明書用DMSO溶解,對(duì)照組細(xì)胞在加載應(yīng)力前用PD98059孵育1 hr�？瞻捉M細(xì)胞用0.04%的DMSO孵育。收集細(xì)胞培養(yǎng)液并ELISA試劑盒檢測(cè)在加載應(yīng)力前加入ERK阻斷劑PD98059探討在ERK/MAPK通路調(diào)節(jié)應(yīng)力下TGF-β的作用。 結(jié)果顯示:SFs在應(yīng)力作用下TGF-β的分泌量增加,尤其在30kPa作用下分泌量增加較多,而在加入ERK特異抑制劑PD98059后,TGF-β的活性得到了顯著抑制。提示在一定的應(yīng)力作用下SFs可通過(guò)提高TGF-β的活性,導(dǎo)致MAPK通路的激活,從而啟動(dòng)自適應(yīng)性改建過(guò)程。 本部分內(nèi)容側(cè)重分析了SFs在HP作用下三種MAPK亞型,ERK,JNK和p38的表達(dá)和活化情況。ERK通路在HP作用下起著重要的調(diào)節(jié)作用,JNK和p38作用不明顯。在30kPaHP作用下加入ERK通路抑制劑PD98059后,SFs分泌TGF-β的活性得到了顯著抑制。進(jìn)一步證明TGF-β介導(dǎo)的ERK通路在SFs受到應(yīng)力作用下引發(fā)的自我適應(yīng)和調(diào)節(jié)的過(guò)程中起著一定作用。而p38和ERK在成骨過(guò)程中起著相反的調(diào)節(jié)作用,分化活性通過(guò)介導(dǎo)黏附分子的表達(dá)在前軟骨階段的后期來(lái)調(diào)節(jié)成骨,在本試驗(yàn)中p38的作用較小。 第四部分丹皮中具有滑膜細(xì)胞保護(hù)作用的化合物篩選 滑膜的過(guò)量炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是TMD的起始因素之一。SFs在應(yīng)力作用下會(huì)加大TNF-α等炎癥因子的分泌量,以啟動(dòng)后續(xù)的病理生理過(guò)程。因此可推測(cè),具有抗炎活性的化合物可用于治療早期的TMD。中藥在治療復(fù)雜性疾病、慢性疾病、免疫疾病等方面具有獨(dú)特的療效和優(yōu)勢(shì)。丹皮提取物能夠抑制ROS堆積,并具有自由基清除能力,另一種與丹皮具有類似化學(xué)組成的中藥材—芍藥的提取物,能夠在抑制關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥反應(yīng),并改變SFs的超微結(jié)構(gòu)。然而,丹皮藥材中具有抗炎活性的化合物及其活性,至今少見報(bào)道。本部分內(nèi)容通過(guò)活性追蹤的方式篩選并鑒定有效成分,確定丹皮提取物及組分的抗炎活性。 實(shí)驗(yàn)六運(yùn)用制備液相色譜分離丹皮提取物得到22個(gè)組分,采用實(shí)驗(yàn)一介紹的原代培養(yǎng)SFs,加入10 ng/mL的IL-1β刺激后,ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中TNF-α含量。并運(yùn)用液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)具有活性的組分進(jìn)行鑒定并分離。 結(jié)果顯示:分離得到的6個(gè)組分能夠顯著抑制IL-1β刺激后的SFs分泌TNF-α。通過(guò)對(duì)活性組分的鑒定從中發(fā)現(xiàn)8種化學(xué)成分。進(jìn)一步研究分離得到的三種化學(xué)成分芍藥苷、丹皮酚和五沒食子酰葡萄糖對(duì)于抑制SFs合成TNF-α和IL-6時(shí)均呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。 近年來(lái),大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明許多中藥提取物和中藥活性成分是一類安全、有效的骨關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療藥物。研究者通過(guò)比較姜黃科的中藥材在關(guān)節(jié)炎小鼠模型上的抗炎活性,找出了一系列有活性的中藥提取物。由此可見,有望從中藥提取物中找出治療TMD的藥物。以往,TMD常采用保守治療,也有研究者嘗試采用關(guān)節(jié)內(nèi)注射超氧化物岐化酶和透明質(zhì)酸鈉的方法進(jìn)行補(bǔ)充治療。本部分研究結(jié)果表明,丹皮提取物中的一些具有抗炎活性的有效化合物通過(guò)控制TMD患者的炎癥反應(yīng)來(lái)達(dá)到預(yù)防和治療的目的。 結(jié)論 1.滑膜細(xì)胞在應(yīng)力作用下形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化,且這種變化程度與應(yīng)力大小有關(guān)。 2.靜水壓力能夠引起滑膜細(xì)胞骨形成相關(guān)蛋白的變化,這種改變與力學(xué)的大小呈現(xiàn)不同趨勢(shì)的變化,說(shuō)明TGF-β、BMP-2和SOX-9對(duì)于滑膜細(xì)胞在應(yīng)力作用下起到不同的調(diào)節(jié)作用。 3.靜水壓力能引起MAPK通路上ERK、JNK、P38等重要信號(hào)分子的改變并引起ERK的活化,提示ERK1/2通路的作用發(fā)揮著重要作用。并且TGF-β介導(dǎo)的ERK通路在滑膜細(xì)胞應(yīng)力作用下的自我適應(yīng)和調(diào)節(jié)過(guò)程中起著信號(hào)傳導(dǎo)的作用。 4.從丹皮藥材中純化得到的三種活性化合物芍藥苷、丹皮酚和五沒食子酰葡萄糖能夠抑制顳下頜關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。
【圖文】：

1.3.1加力裝置及應(yīng)力范圍加力裝置設(shè)計(jì)參考Ozawa介紹的加力裝置，，并作了相應(yīng)的改良簡(jiǎn)化117]。應(yīng)力裝置由四川空氣分離設(shè)備制造有限公司制造，裝置示意圖如圖1一3(A)所示。裝置實(shí)圖如圖1一2(B)所示，罐體是不銹鋼，連接壓力表，并經(jīng)過(guò) 24hLrS密封測(cè)試。將預(yù)先合成的混合氣體(02:NZ:CO:=7.0%:91.3%:1.7%)充入壓力罐，根據(jù)壓力表指示調(diào)整至實(shí)驗(yàn)需要的壓力。細(xì)胞培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于壓力罐內(nèi)，然后將壓力罐置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，保持溫度37℃。相對(duì)濕度>90%。 12hrs后收集細(xì)胞備用。本實(shí)驗(yàn)加載應(yīng)力模式為靜水壓力(hydrostaticpressure，Hp)0沙a， 30kPa， 60kPa和 90kPa加載 12hrs。獷獷節(jié)二詳可 可炸炸壇任找 找卜 卜。。二。.;;; ...二

94.4%士5.6(n=4)。盡管從數(shù)據(jù)上發(fā)現(xiàn)應(yīng)力作用能輕微地抑制于s增殖，但統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)表明，各組間不存在顯著差異。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期，結(jié)果也表明應(yīng)力組和正常組細(xì)胞G2期與Gl期細(xì)胞數(shù)目大致相同(圖14B)。因此，在本實(shí)驗(yàn)所采用的應(yīng)力范圍內(nèi)，汗s生長(zhǎng)基本不受影響。B知.二右Z:.口

本文編號(hào)：2600191