【摘要】： 牙髓炎、根尖周炎和牙周炎等疾病均是G~-厭氧細菌為主的混合感染，而G~-細菌的主要毒力因子就是內毒素。因此，內毒素解毒劑有益于口腔疾病的治療和預防。內毒素(endotoxins，ET)是G~-細菌外膜組份，其化學本質是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，由O-特異性多糖鏈、核心寡糖和類脂A構成，類脂A是內毒素結構中最保守部分，也是內毒素的“毒力中心(endotoxic principle)”，所以類脂A是中和內毒素活性的理想靶標。用小分子中和內毒素活性是一個活躍的研究方向，高親和力是小分子中和內毒素活性的前提和關鍵，小分子分為肽類和非肽類，肽類是研究的主要方向。噬菌體展示肽庫提供了一種根據親和力高低從大量隨機肽序列中篩選目標短肽的方法。本研究以類脂A為靶標篩選噬菌體展示肽庫，化學合成其中一條肽序列并評價其在內毒素中和過程中的作用，主要進行了以下實驗： 一 應用噬菌體展示肽庫技術篩選內毒素類脂A部分的結合肽 用氯仿：甲醇(4：1)混合液溶解類脂A，用甲醇稀釋到所需濃度包被酶聯板孔10μg/孔；以類脂A為靶標篩選噬菌體展示十二肽庫，共篩選三輪；挑選第三輪篩選到的噬菌體，進行ELISA和競爭ELISA鑒定，然后測序，ELISA結果顯示，大部分第三輪洗脫的噬菌體特異結合于包被的類脂A，表明這種包被類脂A的方法是可行的。用20μg/孔的多粘菌素B可以完全競爭抑制噬菌體克隆和類脂A的結合，進一步表明這種方法包被的類脂A能夠被多粘菌素B識別，并且篩選到的噬菌體克隆和多粘菌素B在類脂A上的結合位點相近或相 中文摘要 同。測序結果顯示，其中一條肽AI（HLFNVS－）和多粘菌素B （ttio－K’TK’七 1KK且叢里對）的部分氨基酸組合相似（下劃線標出的殘基人 使用NCBI上的BLASTP尋找最匹配的短序列，可以發(fā)現有些蛋白質含有與 AI氨基酸組合相似的氨基酸序列，這提示這些蛋白質可能與類脂A結合。用 AI全部和部分氨基酸序列檢索美國專利數據庫，沒有發(fā)現申請保護這段序列的 專利，用這段序列中的“ LKK（亮氨酸一賴氨酸一賴氨酸）”檢索到三個有關內毒 素結合和／或中和肽的專利，，這些專利申請保護的多個序列含有LKK組合。 用蛋白質一級結構預測軟件分析了AI肽的一些重要參數。 二 類脂A結合肽的化學合成及其在內毒素中和過程中的作用 固相化學合成 AI序列，CIS柱純化合成肽，在 THP－l細胞模型和小鼠內毒 素致死模型上觀察合成肽的作用。 合成肽的終產物純度為98．56％，質譜測定的合成肽分子量為1495．7與理 論分子量 1495了7一致。 THP一細胞在本培養(yǎng)條件下基本上不分泌TNFa，這主要得益于無內毒素 操作。隨著培養(yǎng)液中內毒素（E colt Oill：B4，Sigma濃度的升高，THPI細胞分 泌 TNFa的量呈“了”狀升高；內毒素濃度在 sng／inl和 200ng／ml的范圍內時， TNF七分泌量呈線性上升，所以選用 50ng／ffil LPS作為刺激濃度。20％FBS， 多粘菌素B可降低內毒素刺激THPl細胞分泌IN’－－－a，4pg／ml多粘菌素B自 夠使 TNF0分泌量降低 43．9％。MTh法檢測 THP－l細胞活力，高濃度多粘菌 素B使細胞活力下降，但多粘菌素B宅4p咖1時不影響活力。無血清時，合成 肽調理增強內毒素刺激THP－1細胞的能力，類似于LBP 20％FBS時，合成肽 的這種調理素樣作用不明顯；20％FBS時，合成肽增強多粘菌素B中和內毒素 的能力。表明這段肽較LBP更傾向于把內毒素轉運向中和途徑。 預實驗的結果顯示，C57BL／6J小鼠對內毒素的敏感程度大于Balb／c小鼠， Balb兒 ’J’鼠對內毒素的敏感程度大于昆明鼠。腹膜內注射 D一氨基半乳糖 10mg 致敏C57BL歷J小鼠（體重。14g），再腹膜內注射內毒素100ng可以得到100％ 死亡率團用卜合成肽單獨不能降低內毒素致死模型小鼠的死亡率p侶）；10pg多 粘菌素 B可以中和 100fig內毒素作用，完全保護小鼠仰卜腹膜內注射 D一氨基 2 中文摘要 半乳糖 10mg致敏后，lpg多粘菌素 B不能降低 200ng內毒素導致的小鼠死亡 率侶／8）；l吃多粘菌素 B和 50陽合成肽能降低 200ng內毒素導致的小鼠死亡率 （4／8）。 三 修飾后的獎脂A結合肽在內年景中和過征中作用的初步研究 AI肽的氨基酸序列（HLNSH一S）和另外一條報道的內毒素中和 肽GZ的氨基酸序列h＊－G’對山紅土生（K”）生）存在一些相同的氨基酸組合 （帶下劃線的殘基），陰影著重標出了疏水氨基酸。根據GZ肽的結構，新設計 一條肽序歹 AI：＊＊。－H’l‘FgN‘VYHSW4L‘K‘”’沁，K’連接于 K‘的。位氨 基，K’連接于 K‘的 a位氨基。固相化學合成 AI’肽，終產物的純度為 94．9％， 質譜測定的合成肽分子量為1535石，與理論分子量1535．86相符。 10％FBS時，30ng／ml TPA活化 THP
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應用噬菌體展示肚庫技術篩選內毒素類脂A部分的結合膚2.5多月太序列的初步分析經軟件計算，Al膚的pHi值約為l0.6(圖1一2):不穩(wěn)定系數(II)為9.97，這表明這段膚是穩(wěn)定的;由于該序列的N端為組氨酸，所以估計的半衰期為3.5小時(哺乳動物網狀細胞，體外);把多膚序列重復一次成24個氨基酸殘基進行Eisenberg疏水性分析(圖1一3)，結果顯示Al膚序列的N端為疏水區(qū)，C端為親水區(qū)。Al月太的螺旋輪(hehcalwheel)顯示該分子有一定的雙歧性、(amphipathieity)[“·‘5〕。Notohorgep曰i~O，0.615圖1一2Al膚的理論滴定曲線

咖娜田卜期圖2一1落卜‘o.c器刁的夕TI翻甘3日..形R勺陣閉‘妞::.自響悅目喊..團‘.d名長防‘.側比闊.由D日aF白‘妞::-0..‘沖臼曰C.宙?zhèn)忍锬c曰甘目】節(jié).0.二翻習O口2”:溺17亡試獲L腸沙MJ峨甲自月下資】凡目口八幾O以:了六宮.叫，.叫匕..目C嘴翔勺翻山曰，M腳O州汗鍺洲叫口陽曰刀‘即份.叼臼r.，知孫“...州月抽卜.口腸書份少.口rl叼目州匆側.爪勺相.即，目。，角‘公曰二腸二國爭，33舀搶‘內翻...，用曰.，‘，曰峨丫.目到..d.于口門戶了目潤憶心N洲口，護..白n腸民月尾曰p“抽
【學位授予單位】：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R780.2

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 王華東,王彥平,戚仁斌,陸大祥,顏亮,李楚杰;二甲亞砜對家兔內毒素性發(fā)熱的影響[J];中國病理生理雜志;2000年06期

2 孫葳,陸大祥,丁勇,李楚杰;甘氨酸對內毒素與單核細胞結合率及內毒素構型的影響[J];中國病理生理雜志;1998年04期

本文編號：2597069