【摘要】：目的:課題組保存了T_1代轉(zhuǎn)基因番茄防齲疫苗種子和含有重組質(zhì)粒pET30a-PAcA的大腸桿菌,在此基礎(chǔ)上制備PAcA蛋白和多克隆抗體,培育T_2代轉(zhuǎn)基因番茄,將其制作成純番茄果汁后灌胃免疫SD大鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答,利用RNA-seq從轉(zhuǎn)錄組水平研究脾臟基因變化,探討轉(zhuǎn)基因番茄防齲疫苗免疫機(jī)制。方法:1、PCR和質(zhì)粒測(cè)序篩選含重組質(zhì)粒pET30a-PAcA的大腸桿菌菌液。2、IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)PAcA蛋白后超聲破碎,純化,Western Blot鑒定蛋白。3、鑒定正確的PAcA蛋白免疫新西蘭大白兔,獲取血清得到多克隆抗體。4、PCR對(duì)T_2代轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行g(shù)us和pacA基因檢測(cè),篩選含有外源基因APB-DOCK8的陽(yáng)性番茄果實(shí)。5、BCA檢測(cè)T_2代轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)總蛋白濃度,ELISA檢測(cè)T_2代轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)融合蛋白濃度,Western Blot檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況。6、動(dòng)物實(shí)驗(yàn):(1)動(dòng)物選擇及分組:25只3周齡健康雌性SD大鼠隨機(jī)分為5組,每組5只,構(gòu)建齲齒模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行灌胃免疫。A組:2 mL/kg轉(zhuǎn)基因番茄果汁組;B組:4 mL/kg轉(zhuǎn)基因番茄果汁組;C組:6 mL/kg轉(zhuǎn)基因番茄果汁組;D組:8 mL/kg轉(zhuǎn)基因番茄果汁組;E組:10 mL/kg轉(zhuǎn)基因番茄果汁組。(2)免疫時(shí)間:每周免疫一次,連續(xù)免疫4周。(3)樣本收集:唾液和血液樣本于第一次免疫前1天及每次免疫7天后收集,直至第7周。(4)抗體檢測(cè):唾液中特異性抗PAcA的SIgA和血清中特異性抗PAcA的IgG含量使用間接ELISA法檢測(cè)。(5)SD大鼠處死后取上下頜骨進(jìn)行Keyes經(jīng)典齲齒計(jì)分。(6)確定轉(zhuǎn)基因番茄果汁最佳免疫劑量和脾臟取樣時(shí)間。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)。7、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序:(1)20只3周齡健康雌性SD大鼠隨機(jī)分為2組,每組10只,實(shí)驗(yàn)組:8 mL/kg轉(zhuǎn)基因番茄果汁組,對(duì)照組:8 mL/kg正常番茄果汁組。(2)其余步驟同動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一。(3)第六周處死SD大鼠,提取脾臟總RNA,帶有Oligo dT的磁珠富集mRNA后進(jìn)行RNA-seq建庫(kù)和測(cè)序分析;取上下頜骨進(jìn)行Keyes經(jīng)典齲齒計(jì)分。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)。結(jié)果:1、PCR和測(cè)序鑒定表明大腸桿菌的質(zhì)粒中含有pacA基因,無(wú)突變。根據(jù)蛋白表達(dá)條件,獲得濃度為0.8284 mg/mL的純化PAcA蛋白,免疫新西蘭大白兔后獲得多克隆抗體。2、PCR測(cè)定T_2代轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)DNA中標(biāo)記基因gus和目的基因pacA,得到含外源基因APB-DOCK8的陽(yáng)性番茄果實(shí)。3、T_2代轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)總蛋白濃度為14.77 mg/mL,融合蛋白濃度為36.28μg/mL,所占比例為0.2456%。T_2代轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)蛋白在173.5 KD大小處出現(xiàn)特異性條帶,符合APB-DOCK8融合蛋白分子大小。4、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,D組在第6周產(chǎn)生的SIgA和IgG抗體水平最高,且與其他組存在顯著差異(P0.05),齲齒計(jì)分也較其他組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5、提取SD大鼠脾臟mRNA,經(jīng)檢測(cè)表明質(zhì)量好,純度高,生物學(xué)重復(fù)性較好;RNA-seq測(cè)序得到40個(gè)mRNA表達(dá)差異顯著基因(P-adjust0.05|Fold Change|≥1.5),26個(gè)基因顯著上調(diào),14個(gè)基因顯著下調(diào)。上調(diào)基因GO注釋到88個(gè)條目,包括體液免疫反應(yīng)(humoral immune response)、B細(xì)胞活化(regulation of B cell activation)等功能,且F0.001,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著;下調(diào)基因GO注釋到307個(gè)條目,但F0.4,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。KEGG分析上調(diào)基因顯著富集的信號(hào)通路56條,包括FcγR介導(dǎo)的吞噬作用(Fc gamma R-mediated phagocytosis)、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)(intestinal immune network for IgA production)、B細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)通路(B cell receptor signaling pathway)等信號(hào)通路,且F0.001,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著;下調(diào)基因富集的信號(hào)通路16條,分析后F0.1,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:1、制備PAcA蛋白和多克隆抗體,培育含有標(biāo)記基因gus、目的基因pacA和目的蛋白APB-DOCK8的轉(zhuǎn)基因防齲番茄,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展提供基礎(chǔ)。2、轉(zhuǎn)基因番茄果汁灌胃免疫SD大鼠后,在第6周時(shí),8mL/kg的劑量組產(chǎn)生的特異性抗體水平最高。3、轉(zhuǎn)基因番茄防齲疫苗免疫SD大鼠后產(chǎn)生特異性抗體,RNA-seq技術(shù)對(duì)其脾臟基因進(jìn)行分析,其中,26個(gè)基因顯著上調(diào),14個(gè)基因顯著下調(diào)。上調(diào)基因GO分析顯著富集到與體液免疫相關(guān)的功能上,如B細(xì)胞活化、體液免疫反應(yīng),KEGG分析顯著富集到B淋巴細(xì)胞活化、抗體產(chǎn)生等信號(hào)通路中;下調(diào)基因的GO分析和KEGG分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因此判定疫苗通過(guò)上調(diào)脾臟相關(guān)免疫基因達(dá)到體液免疫效果,為深入研究疫苗機(jī)制提供理論依據(jù)。
【圖文】：

SD大鼠灌胃免疫（5）樣本收集

SD大鼠采集血液（7）唾液樣本
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R78

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本文編號(hào)：2593801