【摘要】：目的:課題組保存了T_1代轉(zhuǎn)基因番茄防齲疫苗種子和含有重組質(zhì)粒pET30a-PAcA的大腸桿菌,在此基礎(chǔ)上制備PAcA蛋白和多克隆抗體,培育T_2代轉(zhuǎn)基因番茄,將其制作成純番茄果汁后灌胃免疫SD大鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答,利用RNA-seq從轉(zhuǎn)錄組水平研究脾臟基因變化,探討轉(zhuǎn)基因番茄防齲疫苗免疫機(jī)制。方法:1、PCR和質(zhì)粒測序篩選含重組質(zhì)粒pET30a-PAcA的大腸桿菌菌液。2、IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)PAcA蛋白后超聲破碎,純化,Western Blot鑒定蛋白。3、鑒定正確的PAcA蛋白免疫新西蘭大白兔,獲取血清得到多克隆抗體。4、PCR對T_2代轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行g(shù)us和pacA基因檢測,篩選含有外源基因APB-DOCK8的陽性番茄果實。5、BCA檢測T_2代轉(zhuǎn)基因番茄果實總蛋白濃度,ELISA檢測T_2代轉(zhuǎn)基因番茄果實融合蛋白濃度,Western Blot檢測融合蛋白的表達(dá)情況。6、動物實驗:(1)動物選擇及分組:25只3周齡健康雌性SD大鼠隨機(jī)分為5組,每組5只,構(gòu)建齲齒模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行灌胃免疫。A組:2 mL/kg轉(zhuǎn)基因番茄果汁組;B組:4 mL/kg轉(zhuǎn)基因番茄果汁組;C組:6 mL/kg轉(zhuǎn)基因番茄果汁組;D組:8 mL/kg轉(zhuǎn)基因番茄果汁組;E組:10 mL/kg轉(zhuǎn)基因番茄果汁組。(2)免疫時間:每周免疫一次,連續(xù)免疫4周。(3)樣本收集:唾液和血液樣本于第一次免疫前1天及每次免疫7天后收集,直至第7周。(4)抗體檢測:唾液中特異性抗PAcA的SIgA和血清中特異性抗PAcA的IgG含量使用間接ELISA法檢測。(5)SD大鼠處死后取上下頜骨進(jìn)行Keyes經(jīng)典齲齒計分。(6)確定轉(zhuǎn)基因番茄果汁最佳免疫劑量和脾臟取樣時間。該實驗經(jīng)動物倫理委員會審查通過。7、轉(zhuǎn)錄組測序:(1)20只3周齡健康雌性SD大鼠隨機(jī)分為2組,每組10只,實驗組:8 mL/kg轉(zhuǎn)基因番茄果汁組,對照組:8 mL/kg正常番茄果汁組。(2)其余步驟同動物實驗一。(3)第六周處死SD大鼠,提取脾臟總RNA,帶有Oligo dT的磁珠富集mRNA后進(jìn)行RNA-seq建庫和測序分析;取上下頜骨進(jìn)行Keyes經(jīng)典齲齒計分。該實驗經(jīng)動物倫理委員會審查通過。結(jié)果:1、PCR和測序鑒定表明大腸桿菌的質(zhì)粒中含有pacA基因,無突變。根據(jù)蛋白表達(dá)條件,獲得濃度為0.8284 mg/mL的純化PAcA蛋白,免疫新西蘭大白兔后獲得多克隆抗體。2、PCR測定T_2代轉(zhuǎn)基因番茄果實DNA中標(biāo)記基因gus和目的基因pacA,得到含外源基因APB-DOCK8的陽性番茄果實。3、T_2代轉(zhuǎn)基因番茄果實總蛋白濃度為14.77 mg/mL,融合蛋白濃度為36.28μg/mL,所占比例為0.2456%。T_2代轉(zhuǎn)基因番茄果實蛋白在173.5 KD大小處出現(xiàn)特異性條帶,符合APB-DOCK8融合蛋白分子大小。4、動物實驗表明,D組在第6周產(chǎn)生的SIgA和IgG抗體水平最高,且與其他組存在顯著差異(P0.05),齲齒計分也較其他組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5、提取SD大鼠脾臟mRNA,經(jīng)檢測表明質(zhì)量好,純度高,生物學(xué)重復(fù)性較好;RNA-seq測序得到40個mRNA表達(dá)差異顯著基因(P-adjust0.05|Fold Change|≥1.5),26個基因顯著上調(diào),14個基因顯著下調(diào)。上調(diào)基因GO注釋到88個條目,包括體液免疫反應(yīng)(humoral immune response)、B細(xì)胞活化(regulation of B cell activation)等功能,且F0.001,統(tǒng)計學(xué)差異顯著;下調(diào)基因GO注釋到307個條目,但F0.4,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。KEGG分析上調(diào)基因顯著富集的信號通路56條,包括FcγR介導(dǎo)的吞噬作用(Fc gamma R-mediated phagocytosis)、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)(intestinal immune network for IgA production)、B細(xì)胞受體信號傳導(dǎo)通路(B cell receptor signaling pathway)等信號通路,且F0.001,統(tǒng)計學(xué)差異顯著;下調(diào)基因富集的信號通路16條,分析后F0.1,無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論:1、制備PAcA蛋白和多克隆抗體,培育含有標(biāo)記基因gus、目的基因pacA和目的蛋白APB-DOCK8的轉(zhuǎn)基因防齲番茄,為后續(xù)實驗的開展提供基礎(chǔ)。2、轉(zhuǎn)基因番茄果汁灌胃免疫SD大鼠后,在第6周時,8mL/kg的劑量組產(chǎn)生的特異性抗體水平最高。3、轉(zhuǎn)基因番茄防齲疫苗免疫SD大鼠后產(chǎn)生特異性抗體,RNA-seq技術(shù)對其脾臟基因進(jìn)行分析,其中,26個基因顯著上調(diào),14個基因顯著下調(diào)。上調(diào)基因GO分析顯著富集到與體液免疫相關(guān)的功能上,如B細(xì)胞活化、體液免疫反應(yīng),KEGG分析顯著富集到B淋巴細(xì)胞活化、抗體產(chǎn)生等信號通路中;下調(diào)基因的GO分析和KEGG分析差異無統(tǒng)計學(xué)意義,因此判定疫苗通過上調(diào)脾臟相關(guān)免疫基因達(dá)到體液免疫效果,為深入研究疫苗機(jī)制提供理論依據(jù)。
【圖文】：

SD大鼠灌胃免疫（5）樣本收集

SD大鼠采集血液（7）唾液樣本
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R78

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本文編號：2593801