【摘要】：研究目的： 1.針對PRL-1基因，，構(gòu)建PRL-1基因重組慢病毒載體，篩選穩(wěn)定感染siRNA-PRL-1慢病毒及空載病毒的人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞株。 2.探討siRNA-PRL-1重組慢病毒感染人舌鱗癌TCA8113細(xì)胞后，對細(xì)胞增殖、侵襲的影響并探討其可能的機(jī)制。 研究方法： 1.按照Gene bank中PRL-1的mRNA序列(NM_003463),針對該序列設(shè)計(jì)合成5對PRL-1基因的siRNA的寡核苷酸序列，BLAST分析所設(shè)計(jì)序列的特異性。將PRL-1基因特異性siRNA序列構(gòu)建至慢病毒表達(dá)載體GV248上，同時(shí)構(gòu)建PRL-1過表達(dá)質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，Western Blot外源篩選最有效的PRL-1基因的RNAi靶序列。將LV-PRL1siRNA、及輔助包裝原件載體質(zhì)粒pHelper1.0和pHelper2.0這3種質(zhì)粒根據(jù)Invitrogen公司所提供的Lipofectamine2000使用說明書，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生慢病毒，熒光法加藥篩法測定病毒滴度。將構(gòu)建好的PRL-1基因重組慢病毒感染人舌癌Tca8113細(xì)胞株，采用熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)及western blot實(shí)驗(yàn)檢測PRL-1基因的沉默效果，同時(shí)我們使用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組慢病毒及空白病毒的Tca8113細(xì)胞株。 2.實(shí)驗(yàn)設(shè)(1)空白對照組(CON)：未經(jīng)任何處理的Tca8113細(xì)胞；(2)KD：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PRL-1重組慢病毒的Tca8113細(xì)胞(3) NC：轉(zhuǎn)染空白病毒載體的Tca8113細(xì)胞。分別提取各組細(xì)胞總RNA及總蛋白，分別采用熒光定量PCR及western blot方法檢測各組細(xì)胞中PRL-1、MMP-9、MMP-2表達(dá)情況。應(yīng)用Transwell小室實(shí)驗(yàn)方法觀察PRL-1基因沉默對舌鱗癌Tca8113細(xì)胞侵襲的影響。同時(shí)應(yīng)用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察PRL-1重組慢病毒感染對Tca8113細(xì)胞增殖活性的影響。建立裸鼠腫瘤模型，取各實(shí)驗(yàn)組對數(shù)期生長細(xì)胞，接種于裸鼠背部皮下，觀察各組細(xì)胞裸鼠成瘤情況。 結(jié)果： 成功構(gòu)建了PRL-1基因干擾慢病毒載體并獲得相應(yīng)的慢病毒，重組慢病毒可以有效沉默舌鱗癌Tca8113細(xì)胞中PRL-1基因的表達(dá)，與空白對照組相比，siRNA-PRL-1慢病毒轉(zhuǎn)染組癌細(xì)胞PRL-1在RNA（0.4250±0.01）和蛋白（2.7200±0.11）水平明顯下調(diào)（P=0.00，P=0.00），同時(shí)MMP2及MMP9在RNA（0.5622±0.18,0.6171±0.10）及蛋白(0.5924±0.01,0.4762±0.02)表達(dá)水平降低(P=0.024,P=0.010, P=0.00, P=0.00)；Transwell實(shí)驗(yàn)siRNA-PRL-1慢病毒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞通過數(shù)（64.33±4.04）明顯減少（P=0.00）。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)KD組細(xì)胞形成的克隆數(shù)（71.67±10.41）與CON組細(xì)胞形成克隆數(shù)（398.33±10.69）及NC組細(xì)胞形成克隆數(shù)（378.67±13.05）明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了siRNA-PRL-1慢病毒表達(dá)載體，并篩選出穩(wěn)定感染重組慢病毒及空白病毒細(xì)胞株。 2.siRNA-PRL-1基因重組慢病毒載體能有效沉默舌鱗癌Tca8113細(xì)胞中PRL-1基因的表達(dá)。 3.PRL-1重組慢病毒感染下調(diào)PRL-1基因的表達(dá)后人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞的體外增殖、侵襲能力降低。 4.PRL-1基因表達(dá)降低，可引起基質(zhì)金屬蛋白酶-2和-9表達(dá)改變，MMP-2及MMP-9表達(dá)均降低。提示MMP9及MMP2基因表達(dá)下調(diào)，可能是PRL-1siRNA感染抑制舌癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要途徑。
[Abstract]:The purpose of the study is: 1. Aiming at PRL-1 gene, the recombinant lentivirus vector of PRL-1 gene was constructed to screen human tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cell line stably infected with siRNA-PRL-1 lentivirus and no-load virus. two銆

本文編號：2504366