【摘要】：研究背景涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)是較常見的涎腺惡性腫瘤,占涎腺惡性腫瘤的7.5%-10%,可發(fā)生于任何年齡,以40-60歲占絕大多數(shù),但女性稍多于男性,好發(fā)于腮腺、頜下腺、舌下腺和小涎腺如腭腺。SACC具有嗜神經(jīng)侵襲(perineural invasion, PNI)的特性,常侵襲神經(jīng)并沿神經(jīng)生長向遠處轉移,這是區(qū)別于其它頭頸部腫瘤的重要生物學特性之一,并與其復發(fā)、轉移及預后密切相關。SACC的發(fā)展雖較為緩慢,但極易早期侵犯神經(jīng)并循其擴散,導致面癱、麻木、疼痛等神經(jīng)受損癥狀,給臨床治療帶來了很大困難,預后差,因而探討SACC嗜神經(jīng)侵襲的機理具有重要的臨床意義。除SACC外,在惡性黑色素瘤、前列腺癌、胰腺癌、直腸癌中同樣存在癌細胞沿神經(jīng)侵襲的現(xiàn)象。故目前國內外學者傾向于將腫瘤的嗜神經(jīng)侵襲列為除腫瘤局部浸潤、血行轉移、淋巴道轉移、體腔種植4種途徑之外的第5種擴散轉移方式。 惡性腫瘤的嗜神經(jīng)侵襲特性早在一個世紀前就被提出。早期研究認為,PNI主要為腫瘤細胞沿神經(jīng)周圍淋巴管的侵襲,現(xiàn)在認為,神經(jīng)周圍在解剖結構上存在一疏松的潛在間隙,并非淋巴管,腫瘤細胞可沿該阻力最小的間隙生長。這種生長方式提示腫瘤細胞可能在早期即出現(xiàn)遠處轉移,術中即使切除與腫瘤相連的部分神經(jīng),由于在遠處神經(jīng)纖維處已出現(xiàn)癌細胞浸潤,術后復發(fā)的可能性較大。到目前為止,SACC嗜神經(jīng)侵襲的機理尚不清楚,這也是目前國內外研究的熱點。 SACC的嗜神經(jīng)侵襲行為有多種相關基因及信號通路的參與,其中即包括Notch信號通路。Notch信號通路是少數(shù)反復調節(jié)細胞增殖和凋亡的信號轉導系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn),Notch信號通路與細胞的分化、增殖、凋亡、粘附及表皮細胞向間質轉化有密切聯(lián)系,對大多數(shù)組織的正常發(fā)育至關重要。在細胞分化過程中,Notch信號的功能有4個方面：(1)參與胚胎發(fā)育。Notch信號會上調細胞膜表面的Notch分子,同時下調其配體Delta的表達；反之,Delta的表達對細胞自身Notch分子的表達則有下調作用。(2)參與T細胞發(fā)育。(3)維持造血干細胞的自我更新。(4)調節(jié)血管生成。Notch異常調控可引起組織發(fā)育異常,并可能導致腫瘤的發(fā)生,其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用有：維護未分化狀態(tài)；參與細胞命運的決定；誘導終末分化；調節(jié)腫瘤血管新生。其機制是Notch受體在鄰近細胞產(chǎn)生的配體活化作用下,通過一系列分子間的相互作用,依據(jù)不同的組織或細胞背景,對腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡等過程發(fā)揮不同的調控作用。 Notch基因于1919年在果蠅體內發(fā)現(xiàn),該基因的部分功能缺失會在果蠅翅膀的邊緣造成缺口(notch), Notch基因由此而得名。1991年,Notch-1在人類的T淋巴母細胞白血病中首先被鑒定出來,表明了Notch信號通路和腫瘤相關。有研究認為Notch家族基因Notch-1、Notch-2、Notch-4與SACC的發(fā)生、發(fā)展、轉移有關。本課題組在前期研究工作中,結合激光俘獲顯微切割和人類全基因組芯片技術,首次成功構建出SACC嗜神經(jīng)侵襲相關基因表達譜,通過實時定量PCR(qRT-PCR)及免疫組化(IHC)方法加以驗證,并經(jīng)過聚類分析和基因功能分析研究其功能,發(fā)現(xiàn)Notch-1基因在嗜神經(jīng)侵襲組中特異性高表達。該研究結果與近期發(fā)表的另外兩項SACC基因表達譜研究結果相符合。 ACC-M細胞株是1996年從ACC-2細胞株中篩選出肺高轉移性SACC細胞株,其轉移能力與ACC-2相比明顯增強,轉移率由18%提高至96%,轉移灶重量由0.31g提高至0.88g。具有高轉移能力的ACC-M細胞株的建立,對于探討SACC的侵襲、轉移機理及有效選擇抗侵襲、轉移藥物提供了一個極為重要的實驗模型。盡管SACC嗜神經(jīng)侵襲的研究近年來有很大進步,但目前這些研究均尚未系統(tǒng)完全的闡明SACC嗜神經(jīng)侵襲的機理,SACC嗜神經(jīng)侵襲機理的研究尚處于探索階段。迄今國內外均未見Notch-1基因沉默抑制人涎腺腺樣囊性癌高轉移細胞株ACC-M體外嗜神經(jīng)侵襲能力的研究報道。 研究目的利用RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術高效特異地抑制Notch-1基因表達,了解Notch-1基因沉默后,ACC-M細胞體外嗜神經(jīng)侵襲能力的變化。 研究方法 1.建立Notch-1基因RNA干擾穩(wěn)定轉染的ACC-M細胞株。 以Notch-1為靶基因設計shRNA序列,構建重組慢病毒,轉染ACC-M細胞,建立Notch-1基因RNA干擾穩(wěn)定轉染的ACC-M細胞株。 2. Notch-1基因沉默對涎腺腺樣囊性癌高轉移細胞株(ACC-M)體外增殖、嗜神經(jīng)侵襲能力的影響。 通過MTT法測定細胞生長曲線、流式細胞儀檢測細胞周期的變化、改良Transwell細胞嗜神經(jīng)侵襲實驗檢測Notch-1基因沉默對人涎腺ACC-M體外增殖、嗜神經(jīng)侵襲能力的影響。 研究結果 1、成功建立Notch-1基因RNA干擾穩(wěn)定轉染的ACC-M細胞株。通過構建Notch-1RNAi慢病毒表達載體pLenR-GPH-Notch-1,并通過雙酶切及DNA測序加以鑒定；四質粒共轉染293T細胞后可見大量綠色熒光；濃縮病毒后測定其滴度為5.8×108TU/ml;以復感染系數(shù)MO I (multiplicity of infection)為1時感染293T細胞,熒光顯微鏡下觀察到感染效率達90%以上。各組濃縮病毒感染ACC-M細胞后,結合qRT-PCR和Western Blot檢測結果,第三組慢病毒載體干擾效果最佳,Notch-1基因在mRNA及蛋白水平的水平均被顯著抑制。 2、MTT及流式細胞儀研究結果表明,Notch-1基因沉默對ACC-M細胞體外增殖能力無明顯影響。改良Transwell細胞侵襲實驗證實Notch-1基因沉默可顯著抑制ACC-M細胞體外嗜神經(jīng)侵襲能力。 結論 1、Notch-1RNAi慢病毒表達載體及其穩(wěn)定轉染細胞株可高效、特異性阻斷Notch-1基因表達,是研究其功能的良好工具。 2、Notch-1基因沉默對ACC-M細胞體外增殖能力無明顯影響,但可顯著抑制ACC-M細胞體外嗜神經(jīng)侵襲能力,提示Notch-1基因有可能成為SACC嗜神經(jīng)侵襲相關標志物和治療的靶基因。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.87

【參考文獻】

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本文編號：2448515