【摘要】：目的：功能矯形,是矯治處于生長發(fā)育期中的青少年和兒童錯合畸形的一種重要的手段。功能矯治器通過咬合重建引發(fā)一系列的神經(jīng)肌肉收縮力的變化,該力傳遞到口腔周圍的軟硬組織,促進軟硬組織的適應(yīng)性變化,刺激頜骨和牙周組織的生長改建,改變頜骨的自然生長潛力,從而達到錯合畸形的目的。只有面頜部肌肉改建與口腔周圍軟硬組織相協(xié)調(diào),功能矯形的效果才能穩(wěn)定,因此,探討面頜部肌肉適應(yīng)性改建機制對于闡明功能矯形的原理具有指導(dǎo)意義。研究面頜部肌肉組織的適應(yīng)性改建的機制,須從細胞入手。成肌細胞是肌肉組織的干細胞,成肌細胞的增殖、分化和凋亡等生物學(xué)行為在面頜部肌肉的適應(yīng)性改建中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,而成肌細胞的凋亡是當(dāng)今研究的熱點。經(jīng)典的細胞凋亡的途徑有兩條：包括外源性的死亡活化受體途徑和內(nèi)源性的線粒體損傷途徑,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑是近年來逐漸被人們揭示的一條新的凋亡途徑。當(dāng)細胞內(nèi)外環(huán)境的改變引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)聚集,鈣穩(wěn)態(tài)失衡,從而導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂的狀態(tài),發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。為了減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,真核細胞激活一些列自身保護機制,稱為未折疊蛋白反應(yīng)；但持續(xù)的或者過強的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,會導(dǎo)致細胞發(fā)生凋亡。本研究建立在成功構(gòu)建成肌細胞體外培養(yǎng)力學(xué)刺激模型的基礎(chǔ)上,旨在探索周期性應(yīng)力引起成肌細胞凋亡的規(guī)律,探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE-1-JNK信號通路在該過程中的作用及其機制；從而獲得應(yīng)力調(diào)控成肌細胞凋亡的信息,為功能矯形治療中合理使用應(yīng)力以及闡明面頜部肌肉的適應(yīng)性改建的機理提供的理論依據(jù)。 方法：體外培養(yǎng)L6大鼠成肌細胞,應(yīng)用多通道應(yīng)力加載裝置對分別對成肌細胞加載Oh、1h、2h、6h、12h和24h的周期性張應(yīng)力(頻率為10cycles/min,拉伸變形率為15%),構(gòu)建成肌細胞-體外培養(yǎng)力學(xué)刺激模型,對照組為不加力組(0h),對照組與實驗組其他培養(yǎng)條件相同。應(yīng)用Hochest33258染色觀察不同應(yīng)力加載時間對成肌細胞凋亡的影響；應(yīng)用Annexin V-FITC/PI流式細胞術(shù)檢測成肌細胞的凋亡率；采用Real Time PCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子Chop、TRAF2、ASK1和JNK mRNA的表達變化；應(yīng)用Western blotting檢測JNK蛋白的表達變化；加入IRE-1特異性抑制劑STF-083010后檢測TRAF2、ASK1和JNK mRNA和JNK蛋白的表達變化,以明確IRE-1-JNK通路在應(yīng)力介導(dǎo)成肌細胞凋亡中的作用及機制,采用SPSS17.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析。 結(jié)果： 1、Hochest33258染色、Annexin V-FITC/PI流式細胞術(shù)檢測成肌細胞凋亡率,結(jié)果一致表明周期性張應(yīng)力(頻率為10cycles/min,拉伸變形率為15%)可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的成肌細胞發(fā)生凋亡,并且凋亡率隨應(yīng)力加載時間的延長而呈一致上升趨勢,且在24h達峰值。 2、Real Time PCR結(jié)果顯示：CHOP、TRAF2、ASK1mRNA表達量隨應(yīng)力加載時間的延長而逐漸上升,并在24h達最高值,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05); JNK mRNA的表達量在0-2h逐漸上升后逐漸下降,隨后又逐漸上升在24h達最高值,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 3、Western blotting結(jié)果顯示：JNK蛋白隨著應(yīng)力加載時間的延長,先升高,其后略有下降,并于24h達到最高值,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 4、加入大鼠IRE-1特異性抑制劑STF-083010后,Real Time PCR檢測TRAF2、ASK1JNK mRNA表達,結(jié)果顯示：TRAF2、ASK1表達量均明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),與對照組(0h不加抑制劑組)表達量的差別無統(tǒng)計學(xué)差異；JNK表達量與不加抑制劑組明顯降低,但仍高于對照組與對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 5、加入抑制劑后,Western blotting檢測JNK蛋白表達變化,結(jié)果顯示,隨應(yīng)力加載時間的延長,JNK蛋白表達量與不加抑制劑組比較其表達量明顯降低,但仍高于對照組(0h不加抑制劑組),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),但是加抑制劑后各組之間的差別無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 1、周期性張應(yīng)力(頻率為10cycles/min,拉伸變形率為15%)可誘導(dǎo)成肌細胞的凋亡,并且隨著應(yīng)力加載時間的延長,凋亡率隨著應(yīng)力加載時間的延長而升高。 2、CHOP、TRAF2、ASK1、JNK mRNA及JNK蛋白的表達量升高,提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的凋亡途徑參與了應(yīng)力介導(dǎo)的成肌細胞的凋亡 3、加入IRE-1抑制劑后,TRAF2、ASK1、JNK mRNA及JNK蛋白表達量均明顯降低,提示IRE-1-JNK通路參與了應(yīng)力介導(dǎo)的成肌細胞凋亡。 4、加入抑制劑前后JNK mRNA及蛋白的表達變化提示,JNK除了可由IRE-1激活外,還可由其他途徑激活,其具體機制尚有待繼續(xù)深入研究。
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【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R783.5

【參考文獻】

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本文編號：2414360