【摘要】：研究目的人牙根尖乳頭干細胞(stem cells from the apical papilla,SCAPs),是一種來源于正在發(fā)育的牙根尖乳頭組織的間充質(zhì)干細胞,在年輕恒牙的牙根發(fā)育中發(fā)揮重要作用。間充質(zhì)干細胞具有免疫調(diào)控功能,那么SCAPs是否對免疫細胞有一定的調(diào)控作用,目前尚不清楚。單核巨噬細胞在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,被微生物及各種趨化因子活化可產(chǎn)生IL-6、TNF-a等炎性因子,從而導(dǎo)致炎癥的發(fā)生、發(fā)展。根據(jù)巨噬細胞分泌的細胞因子和表型可將其分為兩種極化類型,即促進炎癥發(fā)生的Ml型巨噬細胞和促進組織修復(fù)的M2型巨噬細胞。有研究發(fā)現(xiàn),間充質(zhì)干細胞能夠抑制單核巨噬細胞的活化并促進其向M2型極化從而達到免疫抑制的作用,本實驗初步探討SCAPs對單核巨噬細胞活化和極化的免疫調(diào)控作用。實驗方法和結(jié)果1.細胞培養(yǎng)(1)SCAPs的培養(yǎng):收集因正畸治療需要而拔除的未發(fā)育完全的健康第三磨牙,無菌分離根尖乳頭組織,采用酶消化法分離培養(yǎng)SCAPs。(2)單核細胞系THP-1、U937傳代培養(yǎng)。(3)人單核細胞源性巨噬細胞(Monocyte-derived macrophages,MDM):淋巴細胞分離管分離健康人的外周血獲得外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC),將PBMC細胞懸液置培養(yǎng)皿中過夜,其中的單核細胞可貼壁成巨噬細胞。2.SCAPs促進單核細胞THP-1向M2樣巨噬細胞極化SCAPs與THP-1通過Transwell小室進行共培養(yǎng),實驗組為SCAPs+THP-1;對照組為THP-1。qPCR結(jié)果顯示實驗組THP-1中與Ml型巨噬細胞相關(guān)的TNF-α和IL-12在共培養(yǎng)1d時升高,其余時間點均呈下降趨勢(p0.5),與M2型巨噬細胞相關(guān)的IL-10、TGF-β1、CD163、CD206均升高(p0.5),僅CD206在共培養(yǎng)3d時有下降趨勢;流式細胞術(shù)檢測共培養(yǎng)3d THP-1中TNF-α的表達情況,發(fā)現(xiàn)實驗組的TNF-α表達顯著下降(p0.5),與qPCR結(jié)果一致;Western Blotting 檢測共培養(yǎng)后 THP-1 中 stat3/P-stat3、smad3/P-smad3 的表達情況,發(fā)現(xiàn)實驗組P-stat3/stat3蛋白相對表達水平較對照組呈上升趨勢(p0.5)而P-smad3/smad3蛋白相對表達水平則未見明顯變化(p0.5),表明SCAPs促進THP-1向M2樣巨噬細胞極化,可能與stat3通路的激活有關(guān)。3.SCAPs抑制PMA誘導(dǎo)的巨噬細胞中TNF-a的表達單核細胞系 THP-1、U937 通過佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)誘導(dǎo)成巨噬細胞后與SCAPs共培養(yǎng),實驗組為巨噬細胞+SCAPs;對照組為巨噬細胞。qPCR檢測共培養(yǎng)后巨噬細胞樣THP-1中炎性因子和表面標志物的表達情況,發(fā)現(xiàn)實驗組TNF-α的表達顯著下降(p0.5),而與極化相關(guān)的其他分子則無明顯變化,僅IL-10、CD163在共培養(yǎng)的初期較對照組升高(p0.5),實驗組巨噬細胞樣U937中TNF-α的表達也顯著下降(p0.5)。通過ELISA檢測共培養(yǎng)上清中的TNF-α的表達量,發(fā)現(xiàn)實驗組上清中TNF-α的表達下降(p0.5),進一步證實與SCAPs共培養(yǎng)后,巨噬細胞樣THP-1和巨噬細胞樣U937分泌的TNF-α降低,表明SCAPs對PMA誘導(dǎo)的巨噬細胞極化作用不明顯,卻對TNF-α抑制作用明顯增強。4.SCAPs上清抑制人單核細胞源性巨噬細胞的活化PBMC中的單核細胞貼壁成巨噬細胞后棄上清,加適量的SCAPs條件培養(yǎng)液培養(yǎng)4d,實驗組為SCAPs條件培養(yǎng)液+MDM;對照組為α-MEM培養(yǎng)液+MDM。通過qPCR檢測MDM炎性因子表達情況,實驗組TNF-α、IL-12、IL-6、IL-Iβ的表達均較對照組降低(p0.5),而實驗組IL-10、TGF-β1的表達無明顯變化(p0.5),說明SCAPs上清可以抑制MDM的活化。結(jié)論通過共培養(yǎng),SCAPs可以促進單核細胞THP-1向M2樣巨噬細胞極化,且stat3通路的激活可能參與其中;SCAPs對PMA誘導(dǎo)的巨噬細胞樣THP-1的極化作用不明顯,卻可以顯著抑制巨噬細胞樣THP-1、U937中TNF-α的表達;SCAPs上清能夠抑制人單核細胞源性巨噬細胞的活化。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R781

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本文編號：2407440