【摘要】：口腔癌是頭頸部腫瘤中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其中鱗狀細(xì)胞癌(SCC)是口腔中最常見(jiàn)的惡性腫瘤。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及對(duì)口腔癌發(fā)病機(jī)制研究的深入,口腔癌的治療水平獲得了長(zhǎng)足的進(jìn)步,然而近幾十年口腔癌患者,特別是鱗狀細(xì)胞癌患者,5年生存率提高甚微,仍然只有60%左右。復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致口腔鱗狀細(xì)胞癌患者不良預(yù)后的主要原因。對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)機(jī)制進(jìn)行深入研究,能夠?yàn)榭谇击[狀細(xì)胞癌的預(yù)防及治療提供新的策略。 細(xì)胞融合在人的正常生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用,然而細(xì)胞融合與腫瘤的關(guān)系研究較少。最近的實(shí)驗(yàn)及臨床研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞融合可能與腫瘤發(fā)展的各個(gè)階段都具有緊密聯(lián)系,例如,可能參與了腫瘤的異質(zhì)性及起始、腫瘤干細(xì)胞的起源、多耐藥性及高轉(zhuǎn)移潛能的獲得等過(guò)程。本文從口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)／內(nèi)皮細(xì)胞(EC)融合的角度出發(fā),試圖提示細(xì)胞融合的分子機(jī)制及其在腫瘤微環(huán)境下中的潛在作用。主要研究?jī)?nèi)容如下：①?gòu)捏w外尋找OSCC/EC自發(fā)性融合的證據(jù)并加以鑒定；②探索研究OSCC/EC融合的機(jī)制及相關(guān)通路；③探索研究OSCC/EC融合細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的潛在作用。 實(shí)驗(yàn)一OSCC/EC體外自發(fā)性融合的檢測(cè)及鑒定 目的：探討OSCC與EC在共培養(yǎng)條件下是否發(fā)生自發(fā)性融合。 材料及方法：PKH26標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)與CFSE標(biāo)記的OSCC細(xì)胞系體外共培養(yǎng)24小時(shí),熒光顯微鏡下觀(guān)察雙熒光標(biāo)記細(xì)胞；在慢病毒轉(zhuǎn)染體系下,HUVEC及OSCC細(xì)胞系分別轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(eGFP)和紅色熒光蛋白(RFP),eGFP標(biāo)記的HUVEC與RFP標(biāo)記的OSCC體外共培養(yǎng)24小時(shí),熒光顯微鏡下觀(guān)察雙熒光標(biāo)記細(xì)胞；女性來(lái)源(XX)的HUVEC與男性來(lái)源(XY)的OSCC細(xì)胞系體外共培養(yǎng)24小時(shí),Carnoy's液固定后,熒光原位雜交(FISH)檢測(cè)融合細(xì)胞。 結(jié)果：PKH26標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)與CFSE標(biāo)記的OSCC田胞系體外共培養(yǎng)24小時(shí),熒光顯微鏡下可見(jiàn)橙黃色的雙熒光標(biāo)記的細(xì)胞；在共培養(yǎng)體系下,eGFP標(biāo)記的HUVEC與RFP標(biāo)記的OSCC能夠自發(fā)性融合形成雙熒光標(biāo)記的細(xì)胞,其雙熒光細(xì)胞能夠分裂增殖；女性來(lái)源(XX)的HUVEC與男性來(lái)源(XY)的OSCC體外共培養(yǎng),FISH檢測(cè)結(jié)果示同一細(xì)胞核中存在XXXY染色體,表明HUVEC與OSCC發(fā)生自發(fā)性融合,同時(shí)檢測(cè)到部分細(xì)胞核含有XXXXXXYY染色體且細(xì)胞核處于分裂狀態(tài),表明融合細(xì)胞能夠進(jìn)行核重組且進(jìn)行分裂增殖。Cal-27, SCC4及SCC9與內(nèi)皮細(xì)胞之間的細(xì)胞融合率無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論：OSCC能夠與EC發(fā)生自發(fā)性融合,此種融合細(xì)胞能夠發(fā)生細(xì)胞核重組；重組之后的融合細(xì)胞能夠分裂、增殖。 實(shí)驗(yàn)二VCAM-1/VLA-4通路介導(dǎo)TNF-a促進(jìn)的OSCC/EC融合 目的：探討TNF-a在OSCC與EC融合中的作用及VCAM-1/VLA-4是否介導(dǎo)OSCC/EC融合。 材料及方法：免疫組織化學(xué)(IHC)用于檢測(cè)口腔鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本中VLA-4及VCAM-1的表達(dá)；蛋白質(zhì)免疫印跡(WesternBlot)從蛋白水平分別檢測(cè)OSCC細(xì)胞系及HUVEC中VLA-4及VCAM-1的表達(dá)：在TNF-a刺激條件下,運(yùn)用流式細(xì)胞儀及熒光標(biāo)記法檢測(cè)共培養(yǎng)體系中的細(xì)胞融合狀況；通過(guò)抗體封閉實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證VCAM-1/VLA-4通路在細(xì)胞融合中的作用。 結(jié)果：IHC結(jié)果示：在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本中,腫瘤細(xì)胞表達(dá)VLA-4蛋白,組織標(biāo)本中的血管表達(dá)VCAM-1; Westernblot從蛋白水平進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)OSCC細(xì)胞系表達(dá)VLA-4, TNF-a可誘導(dǎo)HUVEC中VCAM-1的表達(dá)上調(diào)；流式細(xì)胞儀及熒光標(biāo)記法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TNF-a能夠明顯提高OSCC/EC細(xì)胞融合率,而通過(guò)抗體封閉VLA-4及VCAM-1致使TNF-a的促融合作用受到明顯抑制。 結(jié)論：TNF-a能夠促進(jìn)OSCC-EC的融合；VCAM-1/VLA-4通路能夠介導(dǎo)TNF-a的此種促融合作用。 實(shí)驗(yàn)三OSCC/EC融合細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的潛在作用 目的：探討OSCC/EC融合細(xì)胞的生物學(xué)特征及潛在作用。 材料及方法：eGFP標(biāo)記的HUVEC與RFP標(biāo)記的OSCC體外共培養(yǎng),先于多聚甲醛固定前在熒光顯微下定位雙熒光融合細(xì)胞(多聚甲醛固定后RFP熒光消失),分別用波形蛋白(Vimentin)及角蛋白(Cytokeratin)檢測(cè)融合細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)；OSCC細(xì)胞系及融合細(xì)胞用順鉑(Cisplatin)30uM處理36小時(shí),TUNNEL法檢測(cè)OSCC細(xì)胞系及融合細(xì)胞的凋亡狀態(tài)；OSCC細(xì)胞系與融合細(xì)胞混合注入裸鼠體內(nèi),一個(gè)月后取出瘤體,冰凍切片,eGFP及RFP雙熒光染色法及FISH檢測(cè)瘤體內(nèi)的融合細(xì)胞。 結(jié)果：免疫熒光檢測(cè)結(jié)果示：融合細(xì)胞表達(dá)EMT相關(guān)蛋白Vimentin及上皮特異性蛋白Cytokeratin; OSCC細(xì)胞系及融合細(xì)胞用順鉑(Cisplatin)30uM處理36小時(shí),TUNNEL檢測(cè)結(jié)果表明OSCC細(xì)胞系中80%以上的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,然而融合細(xì)胞的凋亡率約30%；在裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,eGFP/RFP雙熒光染色法表明裸鼠瘤體冰凍切片標(biāo)本中存在雙熒光表達(dá)細(xì)胞,FISH法進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)XXXY融合細(xì)胞存在于瘤體標(biāo)本中。 結(jié)論：OSCC/EC融合能夠獲得親代細(xì)胞的某些生物學(xué)表位,此種融合細(xì)胞具有更強(qiáng)的化療藥物抗性,從而使得OSCC-EC融合細(xì)胞能夠具有更強(qiáng)的生存潛能。 綜上所述,在體外共培養(yǎng)條件下OSCC與EC能夠自發(fā)性融合,OSCC/EC融合細(xì)胞能夠發(fā)生核重組,繼而維持分裂、增殖能力,且表達(dá)雙親細(xì)胞標(biāo)記物,具有更強(qiáng)的Cisplatin藥物抗性；炎癥誘導(dǎo)因子TNF-a可通過(guò)VCAM-1/VLA-4通路促進(jìn)OSCC/EC融合。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R739.8

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本文編號(hào)：2379064