【摘要】：隨著社會(huì)的發(fā)展，由各種原因?qū)е碌难例X意外露髓逐漸增多，傳統(tǒng)蓋髓方法效果往往不理想，近年來，越來越多的學(xué)者把牙髓生物學(xué)研究的重點(diǎn)放到了牙髓細(xì)胞上，從細(xì)胞水平為臨床研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 目的：采用組織塊酶解法培養(yǎng)具有干細(xì)胞特性的人牙髓細(xì)胞，通過觀察P物質(zhì)對(duì)體外培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞的增殖、分化及超微結(jié)構(gòu)的影響，探討P物質(zhì)對(duì)體外培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及其作用機(jī)制，為臨床開展活髓保存治療提供一條新的思路。 方法： 1人牙髓細(xì)胞的原代培養(yǎng)及組織來源鑒定 選取因阻生或正畸需要而拔除的健康、完整、無齲、無隱裂恒牙，清理牙齒表面后于無菌條件下取出牙髓組織，采用組織塊酶解法進(jìn)行原代培養(yǎng)，首次傳代選擇原位傳代，以后待細(xì)胞長滿孔底80%后按常規(guī)傳代方法進(jìn)行傳代。取第3代對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用SABC法進(jìn)行波形蛋白、角蛋白免疫組化染色，光鏡下觀察；用HE對(duì)蓋玻片上的細(xì)胞進(jìn)行染色，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。 2人牙髓細(xì)胞生長曲線的檢測 取第3代人牙髓細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以2×104個(gè)/孔的密度接種于24孔板，自接種后第二天開始每天隨機(jī)消化5孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值。連續(xù)計(jì)數(shù)8天，繪制細(xì)胞生長曲線。 3P物質(zhì)對(duì)HDPCs增殖活性的影響 選取第4代人牙髓細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，以2×104個(gè)/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板,每孔200微升。24小時(shí)后，棄去原培養(yǎng)液，隨機(jī)分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，另設(shè)一空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別加入用含1%FBS的DMEM配制的五個(gè)濃度的P物質(zhì)（10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L）；對(duì)照組和空白對(duì)照組只加含1%FBS的DMEM液，以上7組每孔液量均為200微升。分別于培養(yǎng)第1、2、3、4、5天用CCK-8法測定各孔的吸光度值（A450）。 4P物質(zhì)對(duì)HDPCs分化的影響 4.1P物質(zhì)對(duì)HDPCs堿性磷酸酶活性的影響 實(shí)驗(yàn)分組及培養(yǎng)條件同上。分別在藥物作用第1、3、5、7天時(shí)隨機(jī)取出一塊96孔板，，棄培養(yǎng)基，PBS緩沖液沖洗3次，吸干，每孔加入50μl0.1%TritonX-100，4℃冰箱過夜。光鏡下觀察細(xì)胞已無完整結(jié)構(gòu)后，按照堿性磷酸酶試劑盒說明書每孔加入堿性磷酸酶底物100μl，37℃孵育30min，最后以0.2mol/L NaOH50μl終止反應(yīng)，以空白對(duì)照孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測定410nm波長下各孔的吸光度值（A410）。 4.2P物質(zhì)對(duì)HDPCs牙本質(zhì)涎磷蛋白mRNA的影響 取第4代人牙髓細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液后以104個(gè)/ml的濃度接種在25ml培養(yǎng)瓶，每瓶3ml，共6瓶。24小時(shí)后將6瓶細(xì)胞隨機(jī)分為3個(gè)對(duì)照組和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組每瓶加入含1%FBS的培養(yǎng)液3ml，實(shí)驗(yàn)組每瓶加入用含1%FBS的DMEM配制的P物質(zhì)（10-7mol/L）3ml，于培養(yǎng)第7、14、21天分別隨機(jī)取出實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞各1瓶，PBS反復(fù)沖洗3遍，加入Trizol1ml反復(fù)吹打直至細(xì)胞完全裂解，將細(xì)胞收集至無酶EP管中，-80℃保存?zhèn)溆�。以上�?shí)驗(yàn)步驟及分組重復(fù)3次。按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測DSPPmRNA的表達(dá)。 5P物質(zhì)對(duì)HDPCs超微結(jié)構(gòu)的影響 取第4代人牙髓細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液后以2×104個(gè)/ml的濃度接種在25ml培養(yǎng)瓶，每瓶3ml，共6瓶。24小時(shí)后將6個(gè)培養(yǎng)瓶隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各3瓶，實(shí)驗(yàn)組每瓶加入用含1%FBS的DMEM配制的P物質(zhì)（10-7mol/L）3ml,對(duì)照組每瓶加入含1%FBS的培養(yǎng)液3ml。培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞，2.5%戊二醛固定2小時(shí)，常規(guī)樣品制備，透射電鏡下觀察。 6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)作單因素方差分析，采用S-N-K法進(jìn)行多重比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1體外培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞的生物學(xué)特性 采用組織塊酶解法可以成功培養(yǎng)出成纖維樣細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞胞體豐滿，胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核為圓形或卵圓形位于細(xì)胞中央，核仁清晰可見，其生長曲線呈典型的“S”型，經(jīng)免疫組化鑒定，所培養(yǎng)的細(xì)胞波形蛋白染色均為陽性、角蛋白染色均為陰性，證實(shí)為實(shí)驗(yàn)所需要的人牙髓細(xì)胞。 2P物質(zhì)對(duì)人牙髓細(xì)胞增殖與分化的影響 濃度為10-9mol/L~10-5mol/L的P物質(zhì)均可促進(jìn)人牙髓細(xì)胞增殖（P＜0.05），提高人牙髓細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的活性（P＜0.05），促增殖最佳濃度為10-6mol/L，至第5天，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，促分化最佳濃度為10-7mol/L；RT-PCR結(jié)果顯示第7，14，21天，實(shí)驗(yàn)組牙本質(zhì)涎磷蛋白mRNA的表達(dá)量均高于對(duì)照組； 3P物質(zhì)對(duì)人牙髓細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 透射電鏡下可以觀察到人牙髓細(xì)胞經(jīng)過P物質(zhì)作用，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張，線粒體明顯增多，說明P物質(zhì)增強(qiáng)了人牙髓細(xì)胞的合成與分泌功能。 結(jié)論： 1采用組織塊酶解法培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞具備牙髓干細(xì)胞的特征，有良好的增殖和分化能力，可以為各種牙髓生物學(xué)的體外研究提供可靠的細(xì)胞來源。 2一定濃度的P物質(zhì)可以促進(jìn)牙髓細(xì)胞的增殖與分化，增強(qiáng)牙髓細(xì)胞的合成與分泌功能，說明P物質(zhì)在牙髓細(xì)胞的增殖分化過程中發(fā)揮了積極的調(diào)控作用，牙髓損傷的修復(fù)愈合過程可能有賴于P物質(zhì)的參與。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R780.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2377036