發(fā)布時(shí)間：2018-11-15 20:34

【摘要】：背景:慢性牙周炎是具有較高發(fā)病率、以菌斑為始動(dòng)因子的炎性疾病,侵襲破壞牙齦、牙周膜、牙槽骨等牙周組織,致使其再生能力下降甚至喪失,不僅可造成患牙松動(dòng)脫落,還可誘發(fā)糖尿病、心血管疾病等系統(tǒng)性疾病,嚴(yán)重危害口腔乃至全身健康。Ⅱ型糖尿病是以胰島素抵抗和β細(xì)胞功能紊亂為發(fā)病機(jī)理的系統(tǒng)性代謝性疾病,另外還與牙周炎雙向作用從而影響口腔健康。Ⅱ型糖尿病不僅參與改變牙周組織炎癥微環(huán)境,還會(huì)引起牙周骨組織代謝異常,造成骨形成和骨吸收失衡,骨穩(wěn)態(tài)紊亂,從而加快牙周骨質(zhì)流失。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是骨組織代謝或骨改建的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。Ⅱ型糖尿病微環(huán)境下BMSCs的生物學(xué)特征受到一定影響,例如Ⅱ型糖尿病顯著抑制BMSCs成骨分化,是形成糖尿病性骨缺損、牙周炎惡化的重要原因。因此,探究Ⅱ型糖尿病影響B(tài)MSCs成骨分化的機(jī)制,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)控,恢復(fù)其成骨能力,延緩骨組織的退行性改變,重構(gòu)骨組織正常的形態(tài)和功能,為糖尿病性牙周炎治療提供新方法。編碼芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 l(brain and muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein 1,BMAL1)是機(jī)體近日節(jié)律基因家族的核心組件,影響體內(nèi)一系列生理病理反應(yīng),例如維持正常的血糖代謝和促進(jìn)BMSCs成骨分化。因此,BMAL1可能對(duì)Ⅱ型糖尿病條件下BMSCs成骨分化能力起到積極作用,而Ⅱ型糖尿病條件下BMAL1調(diào)控BMSCs成骨分化機(jī)制的研究罕有報(bào)道。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控BMSCs成骨分化的重要通路之一。BMAL1已被證實(shí)與經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路密切相關(guān),然而BMAL1調(diào)控經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性及功能有待深入研究。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase, GSK-3β)不但與Ⅱ型糖尿病相互影響,還是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的重要負(fù)向調(diào)控因子。本課題組前期已證實(shí)高糖微環(huán)境下GSK-3β活性增強(qiáng)進(jìn)而抑制BMSCs的遷移。此外,GSK-3β與BMAL1之間的相互關(guān)系也是研究熱點(diǎn)。前期研究認(rèn)為GSK-3β通過磷酸化BMAL1使其泛素化,影響B(tài)MAL1蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性以及節(jié)律表達(dá)。但是BMAL1也可以通過某些通路間接影響GSK-3β磷酸化。因此,本課題推斷在Ⅱ型糖尿病病理微環(huán)境下BMAL1可能通過GSK-3β改變經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性從而影響B(tài)MSCs的成骨分化。目的:本課題擬探討Ⅱ型糖尿病條件下BMAL1通過經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控BMSCs成骨分化的具體機(jī)制,探究BMAL1干預(yù)恢復(fù)Ⅱ型糖尿病條件下BMSCs的生物學(xué)功能及骨再生能力的可能性,對(duì)糖尿病性牙周炎的病因?qū)W研究、延緩Ⅱ型糖尿病性骨組織損傷進(jìn)而恢復(fù)和重建牙周骨組織形態(tài)和功能奠定理論基礎(chǔ)。方法:第一部分:自8周齡至12周齡連續(xù)測定GK大鼠和Wistar大鼠的體重、隨機(jī)血糖、空腹血糖和空腹胰島素,篩選構(gòu)建自發(fā)性非肥胖性Ⅱ型糖尿病GK大鼠模型。處死GK大鼠和Wistar大鼠后,自大鼠股骨分離獲得BMSCs。應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測兩種來源干細(xì)胞的表面分子標(biāo)志物。干細(xì)胞具有多向分化能力,為了比較兩組BMSCs分化能力差異,對(duì)兩組BMSCs進(jìn)行成脂以及成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn),應(yīng)用qRT-PCR檢測成骨以及成脂的關(guān)鍵基因RUNX2、OCN和PPARγ、LPL。為檢測兩組BMSCs衰老程度差異,本課題對(duì)兩組干細(xì)胞進(jìn)行SA-β-gal染色并應(yīng)用qRT-PCR檢測相對(duì)端粒長度和端粒酶活性。為比較兩組BMSCs的增殖和凋亡,本課題檢測其克隆形成率,應(yīng)用MTT法以及流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞活性的檢測。應(yīng)用qRT-PCR檢測兩組BMSCs中增殖相關(guān)因子CCND1、CDK4和炎性因子IL-1β、TNF-αmRNA表達(dá)水平。第二部分:應(yīng)用Western blot檢測GK大鼠和Wistar大鼠BMSCs總蛋白中BMAL1的表達(dá)。GK大鼠和Wistar大鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)7天后,應(yīng)用Western blot檢測GK大鼠和Wistar大鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)前后細(xì)胞核蛋白中BMAL1的表達(dá),按照上述分組應(yīng)用qRT-PCR檢測BMSCs成骨誘導(dǎo)前后BMAL1 mRNA表達(dá)水平。其次,本課題探究Ⅱ型糖尿病條件下BMAL1表達(dá)變化對(duì)BMSCs成骨分化能力的影響。GK大鼠和Wistar大鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)7天后,應(yīng)用ALP染色、ALP活性檢測以及qRT-PCR從不同角度比較兩組干細(xì)胞的成骨分化能力。第三部分:應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測GK大鼠和Wistar大鼠BMSCs中GSK-3β的表達(dá),同時(shí)應(yīng)用Western blot定量比較兩組干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)前后細(xì)胞質(zhì)蛋白中GSK-3β的表達(dá)水平。其次,應(yīng)用Western blot檢測GK大鼠和Wistar大鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)前后細(xì)胞質(zhì)蛋白中act-β-catenin以及細(xì)胞核蛋白中β-catenin、NLK、TCF的表達(dá)水平。為驗(yàn)證Ⅱ型糖尿病通過BMAL1影響GSK-3β表達(dá)及經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性,首先本課題構(gòu)建BMAL1過表達(dá)慢病毒載體并轉(zhuǎn)染至兩組BMSCs,應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行測定,應(yīng)用Western blot和qRT-PCR檢測兩組BMSCs轉(zhuǎn)染前后BMAL1蛋白及mRNA的表達(dá)水平。然后應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測BMAL1過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后GK大鼠和Wistar大鼠BMSCs中GSK-3β的表達(dá),并應(yīng)用Western blot定量測定兩組干細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞質(zhì)蛋白中GSK-3β、act-β-catenin、β-catenin的表達(dá)變化。其次本課題應(yīng)用GSK-3β抑制劑CHIR99021抑制GK組BMSCs中GSK-3β活性,應(yīng)用Western blot檢測Wistar組、GK組、GK-CHIR組BMSCs細(xì)胞質(zhì)蛋白中GSK-3β、BMAL1、act-β-catenin以及細(xì)胞核蛋白中NLK、TCF的表達(dá)變化。同時(shí)應(yīng)用CHIR99021抑制BMAL1過表達(dá)的GK組BMSCs中GSK-3β活性,應(yīng)用Western blot檢測細(xì)胞質(zhì)蛋白中GSK-3β、β-catenin、act-β-catenin以及細(xì)胞核蛋白中TCF的表達(dá)變化。第四部分:為驗(yàn)證Ⅱ型糖尿病條件下BMAL1過表達(dá)有效恢復(fù)BMSCs成骨分化的作用,本課題首先應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測BMAL1過表達(dá)并成骨誘導(dǎo)7天后GK大鼠BMSCs中成骨標(biāo)記物OCN的表達(dá)變化。同時(shí)應(yīng)用ALP染色和qRT-PCR從不同角度檢測GK大鼠和Wistar大鼠干細(xì)胞BMAL1過表達(dá)并成骨誘導(dǎo)后RUNX2、OCN、ALP的表達(dá)水平。本課題還應(yīng)用qRT-PCR檢測BMAL1過表達(dá)后GK大鼠和Wistar大鼠BMSCs中IL-1β、TNF-αmRNA表達(dá)水平。結(jié)果:第一部分:Ⅱ型糖尿病條件下BMSCs生物學(xué)特征的變化1、以空腹血糖大于11.1mmol/L或OGTT實(shí)驗(yàn)120min后血糖大于16.7mmol/L為標(biāo)準(zhǔn),本課題Ⅱ型糖尿病GK大鼠模型建模成功率為83.3%,10只12周齡GK大鼠表現(xiàn)出穩(wěn)定的Ⅱ型糖尿病癥狀。2、GK組和Wistar組BMSCs均呈長梭形克隆化生長,表面標(biāo)記物表達(dá)無顯著性差異:陽性表達(dá) CD90、CD105、CD146 和 Stro-1,陰性表達(dá) CD14 和 CD31。3、GK組BMSCs的成脂和成骨化能力顯著低于Wistar組BMSCs。4、GK組BMSCs SA-β-Gal染色、端粒相對(duì)長度和端粒酶活性與Wistar組BMSCs比較無顯著差異。5、GK組BMSCs的克隆形成及細(xì)胞增殖能力顯著低于Wistar組BMSCs,但是促炎因子IL-1β、TNF-αmRNA表達(dá)水平顯著高于Wistar組BMSCs。第二部分:Ⅱ型糖尿病條件下BMAL1影響B(tài)MSCs成骨分化1、GK組BMSCs總蛋白中BMAL1表達(dá)水平顯著低于Wistar組BMSCs。2、GK組BMSCs成骨誘導(dǎo)7天后BMAL1蛋白及mRNA表達(dá)水平較常規(guī)培養(yǎng)顯著增高,但顯著低于相應(yīng)Wistar組BMSCs。3、與Ⅱ型糖尿病條件下BMAL1的表達(dá)變化相對(duì)應(yīng),兩組BMSCs成骨誘導(dǎo)7天后GK組ALP染色面積及ALP相對(duì)活性顯著低于Wistar組。4、qRT-PCR 結(jié)果顯示 GK 組 BMSCs 成骨誘導(dǎo) 7 天后 ALP、OCN、RUNX2 mRNA較誘導(dǎo)前顯著增高,但顯著低于Wistar組BMSCs。第三部分:Ⅱ型糖尿病條件下BMAL1通過GSK-3β調(diào)控經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性1、細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示GK組BMSCs中GSK-3ββ陽性表達(dá)率顯著高于Wistar組BMSCs。2、GK組BMSCs成骨誘導(dǎo)后GSK-3β蛋白表達(dá)水平顯著降低,但明顯高于Wistar組BMSCs 。3、GK組BMSCs中細(xì)胞質(zhì)蛋白act-β-catenin、細(xì)胞核蛋白β-catenin、TCF表達(dá)趨勢與GSK-3β相反,即成骨誘導(dǎo)后顯著增強(qiáng)但明顯低于Wistar組,但是細(xì)胞核蛋白NLK表達(dá)趨勢與GSK-3β相同。4、BMAL1過表達(dá)載體以較高效率轉(zhuǎn)染至GK組BMSCs后,GK組干細(xì)胞中BMAL1蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著增強(qiáng)。5、BMAL1過表達(dá)后GK組BMSCs中GSK-3β陽性表達(dá)率明顯降低。6、BMAL1過表達(dá)后GK組BMSCs細(xì)胞質(zhì)蛋白中GSK-3β表達(dá)水平顯著降低,但仍高于 Wistar 組 BMSCs;但 act-β-catenin、β-catenin 表達(dá)趨勢與 GSK-3β 相反。7、應(yīng)用CHIR99021后,GK組BMSCs細(xì)胞質(zhì)蛋白中GSK-3β表達(dá)水平顯著降低,但是act-β-catenin、BMAL1表達(dá)水平無顯著變化,而細(xì)胞核蛋白中NLK、TCF表達(dá)水平顯著增強(qiáng)。8、BMAL1過表達(dá)后再應(yīng)用CHIR99021, GK組BMSCs細(xì)胞質(zhì)蛋白中BMAL1較轉(zhuǎn)染后無顯著差異,但是細(xì)胞質(zhì)蛋白中act-β-catenin、β-catenin、細(xì)胞核蛋白中TCF均有明顯變化。第四部分:Ⅱ型糖尿病條件下BMAL1過表達(dá)恢復(fù)BMSCs成骨分化能力1、BMAL1過表達(dá)后GK組BMSCs中OCN陽性表達(dá)率增高,ALP染色深度以及OCN、RUNX2mRNA表達(dá)水平明顯增強(qiáng)。2、BMAL1過表達(dá)后GK組BMSCs中TNF-α mRNA表達(dá)水平明顯降低,但I(xiàn)L-1β無明顯變化。結(jié)論:1、Ⅱ型糖尿病顯著抑制BMSCs的增殖能力以及多向分化潛能。2、Ⅱ型糖尿病條件下干細(xì)胞中BMAL1表達(dá)下調(diào)是導(dǎo)致BMSCs成骨分化能力降低的重要原因。3、Ⅱ型糖尿病抑制BMAL1表達(dá),繼而BMAL1對(duì)GSK-3β的負(fù)向調(diào)控作用減弱,降低經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性,最終抑制BMSCs成骨分化能力。4、Ⅱ型糖尿病條件下上調(diào)BMSCs中BMAL1表達(dá),可以有效抑制GSK-3β表達(dá)、恢復(fù)經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性,促進(jìn)BMSCs成骨分化,為Ⅱ型糖尿病條件下延緩骨組織破壞、恢復(fù)和重建其形態(tài)功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R781.42;R587.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 左曉虹;蔡彥寧;李寧;劉姝;張燕莉;陳彪;;小鼠紋狀體時(shí)鐘基因表達(dá)的生后發(fā)育[J];中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志;2009年05期

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本文編號(hào)：2334380