【摘要】：[目的]1、建立SD大鼠乳鼠顳下頜關節(jié)髁突軟骨下骨、膝關節(jié)脛骨軟骨下骨體外分離培養(yǎng)成骨細胞的原代及傳代培養(yǎng)模型；2、對來源于顳下頜關節(jié)髁突軟骨下骨、膝關節(jié)脛骨軟骨下骨的成骨細胞進行連續(xù)觀察,探討其生物學活性；3、進一步研究顳下頜關節(jié)髁突軟骨下骨、膝關節(jié)脛骨軟骨下骨來源的成骨細胞的增殖與成骨活性。 [方法]1、分別取顳下頜關節(jié)髁突軟骨下骨、膝關節(jié)脛骨軟骨下骨組織進行成骨細胞的培養(yǎng),兩種成骨細胞均采用Ⅰ型膠原酶消化法進行原代培養(yǎng),并采用“差速貼壁法”進行兩種細胞的純化培養(yǎng),在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察兩種成骨細胞的生長狀況、形態(tài)學和生物學特性；2、通過HE染色、ALP染色、鈣化結(jié)節(jié)茜素紅S染色,鑒定兩種不同來源第4代成骨細胞；3、采用細胞計數(shù)、MTT生長曲線及流式細胞周期的測定來比較兩種不同來源成骨細胞的增殖能力；4、通過檢測堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨鈣素(osteocalcin, OC)和Ⅰ型膠原(collagen I, COL-I) mRNA的表達量,比較兩種不同來源成骨細胞的成骨能力。 [結(jié)果]1、兩種不同來源成骨細胞培養(yǎng)形態(tài)無明顯差別,大約培養(yǎng)24h后即可貼壁、伸展,貼壁時細胞均較小,呈星形、三角形及短梭形,胞核不明顯,隨著細胞生長分化,細胞表面有突觸并相互之間連結(jié),彼此間融合后向多層生長。傳代生長至第4代時,細胞形態(tài)胞體大,形態(tài)以多角形、長梭形為主,胞核明顯增大,同時細胞外基質(zhì)分泌增多,并包裹細胞,繼而形成細胞團塊,透光性減弱,最終形成鈣結(jié)節(jié),符合成骨細胞的生長特性； 2、兩種不同來源成骨細胞HE染色、ALP染色、鈣化結(jié)節(jié)茜素紅S染色呈現(xiàn)強陽性反應,經(jīng)鑒定為成骨細胞； 3、細胞計數(shù)顯示顳下頜關節(jié)髁突軟骨下骨成骨細胞量明顯低于膝關節(jié)脛骨軟骨下骨成骨細胞量,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05); MTT生長曲線結(jié)果顯示,顳下頜關節(jié)髁突軟骨下骨成骨細胞在接種后4d進入對數(shù)生長期,第8d達到峰值,此后進入平臺期及生長衰減期,膝關節(jié)脛骨軟骨下骨成骨細胞在接種后3d進入對數(shù)生長期,第7d達到峰值,此后進入平臺期及生長衰減期；流式細胞生長周期結(jié)果顯示,顳下頜關節(jié)髁突軟骨下骨成骨細胞G0/G1期比例為62.90±3.15%,膝關節(jié)脛骨軟骨下骨成骨細胞G0/G1期比例為52.10±5.24%,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)；顳下頜關節(jié)G2/S/M期比例為37.10±2.15%,膝關節(jié)G2/S/M期比例為47.90±3.24%,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05) 4、在同一時間顳下頜關節(jié)髁突軟骨下骨成骨細胞ALP、COL-I的表達量較膝關節(jié)脛骨軟骨下骨成骨細胞高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)；在同一時間顳下頜關節(jié)髁突軟骨下骨成骨細胞OC的表達量較膝關節(jié)脛骨軟骨下骨成骨細胞低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)；在不同時間顳下頜關節(jié)髁突軟骨下骨成骨細胞組內(nèi)及膝關節(jié)脛骨軟骨下骨成骨細胞組內(nèi)ALP的表達含量隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸降低,而COL-I、OC則相反,表達量逐漸升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)； [結(jié)論]1、來源于SD大鼠乳鼠顳下頜關節(jié)髁突軟骨下骨及膝關節(jié)脛骨軟骨下骨的原代細胞,經(jīng)體外培養(yǎng)均可得到均一性好、具有典型成骨細胞形態(tài)特征的成骨細胞； 2、兩種不同來源的細胞經(jīng)鑒定為成骨細胞； 3、本實驗細胞計數(shù)、MTT及流式細胞周期結(jié)果顯示顳下頜關節(jié)髁突來源的軟骨下骨成骨細胞增殖能力低于膝關節(jié)脛骨來源的軟骨下骨成骨細胞； 4、本實驗ALP、COL-I定量檢測結(jié)果顳下頜關節(jié)髁突軟骨下骨成骨細胞成骨能力在ALP、COL-I方面強于膝關節(jié)脛骨軟骨下骨成骨細胞,這與兩種關節(jié)成骨細胞增殖能力比較的結(jié)論相反,呈反比關系；而OC的檢測結(jié)果提示顳下頜關節(jié)髁突軟骨下骨成骨細胞成骨能力在OC方面弱于膝關節(jié)脛骨軟骨下骨成骨細胞,可能的原因是OC的表達和成骨細胞的數(shù)目及增殖狀態(tài)呈正相關,顳下頜關節(jié)來源的成骨細胞增殖活性弱于膝關節(jié)來源的成骨細胞,故顳下頜關節(jié)來源的成骨細胞OC成骨表達能力低于膝關節(jié)來源成骨細胞的OC表達能力。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R782.6

【參考文獻】

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本文編號：2333822