【摘要】：種子細胞是組織工程研究與應用中最為關鍵的要素之一，是組織工程化組織能夠再生的首要物質基礎。目前研究所用的種子細胞從來源上可以劃分為自體細胞、同種異體細胞和異種細胞。從分化程度上可以劃分為胚胎干細胞、成體干細胞、定向祖細胞和分化成熟細胞。同種異體細胞和異種細胞雖然來源較為廣泛，但存在免疫排斥和細胞功能差異等問題，胚胎干細胞則很難獲得定向分化純度較高的種子細胞，而且還存在倫理問題，因此目前真正用于組織工程化組織構建與組織缺損修復的種子細胞仍然是以自體來源的干細胞為主。作為組織工程種子細胞應滿足如下幾點要求：體外擴增能力強，能進行大規(guī)模的擴增；活力和功能良好，具備構建組織的特定生物學性能；細胞純度高，具備特定的生物學功能的細胞占主導；不發(fā)生免疫排斥反應；生物安全性好。骨髓間充質干細胞恰恰符合上述要求，并且其來源廣泛，數量充足，體內可再生；取材安全方便，供區(qū)創(chuàng)傷較��；細胞培養(yǎng)技術簡單易行。但組織工程應用時所需要的種子細胞是大量的，單純的體外擴增培養(yǎng)很難在有限時間內擴增出所需要的量，于是，尋找可以高效體外擴增骨髓間充質干細胞的方法勢在必行。目前的研究顯示，特定序列的寡核苷酸(Oligonucleotide，ODN)對人牙周膜細胞、大鼠骨髓間充質干細胞、牙齦卟啉單胞菌感染成骨細胞和MG63細胞的增殖具有顯著的促進作用。故我們建立了“一定濃度的特定序列寡核苷酸可能促進hBMSCs的增殖”這樣一個科學假設，篩選出對hBMSCs的增殖具有促進作用的ODN，為ODN的應用提供理論參考和為后續(xù)的實驗奠定實驗基礎。實驗分為如下三個部分： 第一部分.hBMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 密度梯度離心法獲取健康成人hBMSCs，觀察其細胞形態(tài)，，取第3代hBMSCs以1.0×104/cm2的密度接種于6孔板，分別加入成骨、成脂和成軟骨誘導液，每72h換液，2-3周后分別進行茜素紅、油紅O和甲苯胺藍染色，干細胞表面分子的流式細胞儀鑒定。 第二部分.hBMSCs最佳鋪板濃度的確定 將第3代hBMSCs分別以3.0×103/cm2、6.0×103/cm2、1.2×104/cm2、2.4×104/cm2的濃度接種于96孔板，每孔200ul完全培養(yǎng)基，第4天換液，酶標儀檢測CCK-8（測定波長450nm，參比波長630nm）光密度值，連續(xù)檢測7天，觀察生長曲線，確立最佳鋪板密度。 第三部分.ODN saf5、FC003、MT01對hBMSCs增殖的影響 將第3代hBMSCs以最佳鋪板密度接種于96孔板，每孔200ul完全培養(yǎng)基，依據ODN種類（MT01、FC003、Sa05f）和終濃度（0.5mg/L，1.0mg/L，2.0mg/L，4.0mg/L）分為12個實驗組，每組4復孔，對照組加入等量PBS，酶標儀檢測CCK-8（測定波長450nm，參比波長630nm）光密度值，連續(xù)檢測3天，確立對hBMSCs增殖有影響的ODN。實驗結果如下： 第一部分 密度梯度離心法分離培養(yǎng)純化的細胞生長良好，第3代hBMSCs單個成紡錘形，大量增殖后呈旋渦狀排列;成骨誘導21天后，培養(yǎng)皿中固定細胞后茜素紅染色，可見大量橘紅色的礦化結節(jié)；成脂誘導15天后，培養(yǎng)皿中固定細胞后油紅O染色，可見大量的暗紅色脂滴形成；成軟骨誘導21天后，培養(yǎng)皿中固定細胞后甲苯胺藍染色，可見胞漿中的淡藍色異染顆粒及細胞外基質被染成淺藍色;經流式細胞儀檢測，細胞CD90的陽性表達率為99.6%；細胞CD73的陽性表達率為99.9%；細胞CD105的陽性表達率為96.5%;細胞CD34/45/116的綜合陽性表達率為0.51%。 第二部分 根據CCK-8連續(xù)檢測7天的結果繪制的生長曲線顯示，以6×103/cm2為鋪板密度的hBMSCs生長曲線最佳。 第三部分 在加入每種不同濃度的ODN后，與對照組相比，終濃度為0.5mg/L的ODN FC003在第1天檢測到吸光值顯著升高（P0.01）；終濃度為1.0mg/L和4.0mg/L的ODN Sa05f 在第1天檢測到吸光值均顯著降低（分別為P0.01，P0.05）；終濃度為2.0mg/L的ODN MT01在連續(xù)3天內的吸光值均明顯升高，差異具有統計學意義（第1天P0.01，第2,3天P0.05）。 以上實驗結果證實： 本實驗利用密度梯度離心法分離純化的hBMSCs，在標準的培養(yǎng)條件下MSCs能貼塑料瓶壁生長；在體外能向成骨細胞、脂肪細胞及軟骨細胞分化；符合Dominici M于2006年在Cytotherapy雜志上發(fā)表了關于人的MSCs鑒定的最低標準，為實驗的后續(xù)研究奠定基礎；以6.0×103/cm2的接種密度鋪板可獲得良好的細胞生長曲線；終濃度為2.0mg/L的ODN MT01可顯著促進hBMSCs的增殖。 總之，作為抑制型寡核苷酸的ODN MT01可以促進hBMSCs的增殖；本研究為組織工程種子細胞的體外擴增提供了新的思路和一定的理論參考；然而，對于ODN MT01促進增殖的機制和實際應用，我們還需要大量的工作來完成。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：佳木斯大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R782

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 賈延R

本文編號：2328054