【摘要】：隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、人民生活水平提高以及口腔修復(fù)意識(shí)的進(jìn)步,越來(lái)越多牙列缺損或牙列缺失的患者選擇種植義齒修復(fù)缺失牙。種植義齒成功關(guān)鍵在于種植體植入后與骨形成良好的骨整合。20世紀(jì)60年代Branemark教授創(chuàng)立的骨結(jié)合理論奠定了現(xiàn)代口腔種植學(xué)的生物學(xué)基礎(chǔ),骨結(jié)合理論是指：有生命的骨組織(bone)與種植體(implant)之間的直接結(jié)合,無(wú)纖維組織圍繞種植體,這種結(jié)合必須而且能夠承受負(fù)重。 目前口腔種植體常用的材料主要是純鈦、鈦合金以及一些復(fù)合材料。純金屬鈦具有質(zhì)輕,對(duì)震動(dòng)減幅力大,低彈性模量等優(yōu)點(diǎn),同時(shí)具有較高的硬度、極限抗拉(張)強(qiáng)度、屈服強(qiáng)度、疲勞強(qiáng)度以及抗腐蝕性疲勞極限等特點(diǎn),因此純鈦種植體的應(yīng)用比較廣泛。不僅如此,由于鈦及鈦合金具有優(yōu)點(diǎn),近年來(lái),鈦合金在骨科臨床方面得到了廣泛的應(yīng)用。已成為口腔醫(yī)學(xué)及矯形外科領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的材料。 但不足之處是鈦屬于生物惰性材料,在臨床應(yīng)用中所需愈合時(shí)間較長(zhǎng),且植入機(jī)體后組織反應(yīng)表現(xiàn)為非特異性和隨機(jī)性。因此,努力探索新的種植體表面改性方法獲得新型的種植體,在保證高種植成功率的同時(shí)顯著縮短種植體與牙槽骨發(fā)生骨整合的時(shí)間,減輕患者的痛苦,不僅有較大的科學(xué)意義而且有實(shí)際的臨床應(yīng)用前景。 在近二十年的研究當(dāng)中,鈦表面處理方法,誘導(dǎo)成骨因子,成骨因子相關(guān)基因以及包裹基因的載體,載體的修飾,構(gòu)建成功的復(fù)合體與鈦表面的結(jié)合方法這幾個(gè)方面成為了研究的熱點(diǎn)與重點(diǎn)。大量的研究表明,經(jīng)過(guò)物理化學(xué)處理后的鈦基種植體的初期穩(wěn)定性和長(zhǎng)期成功率都明顯高于沒(méi)有進(jìn)行表面粗化處理的種植體。原因可能有兩方面,一是經(jīng)過(guò)物理化學(xué)處理后的種植體表面的無(wú)機(jī)成分可能有利于成骨細(xì)胞的粘附、增殖和分化,從而促進(jìn)骨整合；二是粗化表面大大增加了種植體的表面積,提高機(jī)械嵌合力,增加種植體的初期穩(wěn)定性。 隨著研究的深入,將功能明確的活性物質(zhì)引入種植體表面的生物化學(xué)改性研究已逐漸成為種植體研究的熱點(diǎn)。相對(duì)于其他物理化學(xué)方法,這種方法直接利用對(duì)成骨細(xì)胞的功能表達(dá)有促進(jìn)作用的活性分子來(lái)影響組織反應(yīng),促進(jìn)新骨形成因而這種方法較傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法更為直接有效,有望獲得比無(wú)機(jī)表面的種植體更快的骨整合速度。研究顯示功能性蛋白(纖維粘連蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、細(xì)胞粘附短肽RGD等)可以被引入到種植體表面。 其中hBMP2是已知的具有強(qiáng)成骨誘導(dǎo)能力的一類生長(zhǎng)因子。hBMP2作為骨生長(zhǎng)促進(jìn)因子,廣泛存在于人的硬組織中,主要分布在具有成骨傾向的細(xì)胞漿中,包括成骨、成釉及成牙本質(zhì)細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞等,具有誘導(dǎo)成骨作用,能夠誘發(fā)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞,hBMP2在可以克隆的7個(gè)hBMP成員基因中誘導(dǎo)骨形成活性最強(qiáng)。但單純的]hBMP2在體內(nèi)代謝較快,難以形成持續(xù)作用,且蛋白本身仍較基因體積大,影響種植體表面厚度。由此可見(jiàn),選擇一種合適的載體有效而可控的將活性分子基因引入到種植體表面并保持其良好的生物活性；同時(shí)控制種植體表面活性分子的釋放,使其在合適的時(shí)間段對(duì)細(xì)胞增殖分化和組織重構(gòu)保持合適的濃度,是我們應(yīng)該關(guān)注的種植體表面生物活性化的根本問(wèn)題。 基因載體可分為病毒載體和非病毒載體,病毒類載體有較高的轉(zhuǎn)染效率,但具有一些安全性問(wèn)題,如病毒重組、免疫原性等,因此利用非病毒載體系統(tǒng)攜帶靶基因進(jìn)行基因治療較病毒類載體更為安全。在眾多非病毒載體系統(tǒng)中,陽(yáng)離子聚合物是一種非常有前景的載體。殼聚糖是存在于自然界中的唯一種帶陽(yáng)離子的能生物降解的納米粒載體材料,具有良好的生物相容性、可降解性和粘膜粘附性,特別適合包載蛋白質(zhì)、多肽、疫苗和基因等生物活性大分子[18]�，F(xiàn)殼聚糖主要作為代替脂質(zhì)體及病毒類載體作為藥物、蛋白、基因等的載體被人們廣泛研究。殼聚糖可以通過(guò)分子表面的正電荷與帶負(fù)電荷的DNA相結(jié)合,阻止DNA酶(DNasel)對(duì)DNA的降解,有效濃縮DNA[19],此外還具有黏附作用強(qiáng)、毒副作用小、來(lái)源豐富、價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)。但殼聚糖的低靶向性和低轉(zhuǎn)染效率這一局限性往往會(huì)限制了它的應(yīng)用。為提高其靶向性以及轉(zhuǎn)染效率,許多研究在殼聚糖分子上進(jìn)行短肽修飾,以達(dá)到提高其轉(zhuǎn)染效率的目的。 RGD肽是一類含精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列在生物體內(nèi)廣泛存在的短肽,是整合素(Intedrin)和其配體之間相互作用的識(shí)別位點(diǎn),能與11種整合素特異性結(jié)合,能促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng),促使骨組織再生,抑制破骨細(xì)胞之間及其與基質(zhì)之間的黏附。RGD小分子靶向肽修飾殼聚糖作為基因表達(dá)載體,其轉(zhuǎn)染效率較單純殼聚糖作為載體有明顯的提高。同時(shí),還有研究[26-27]發(fā)現(xiàn),將RGD短肽固定在種植體表面,能促使種植體四周新骨生長(zhǎng),使種植體的抗拉力增強(qiáng)。因此,將RGD與殼聚糖接枝,即改善了殼聚糖基因載體的性能,亦可改善種植體表面性能,從基因和肽水平同時(shí)促進(jìn)鈦種植體表面的成骨。 目前在鈦種植體表面固定和/或釋放生物大分子的方法主要包括物理吸附法、化學(xué)固定法、層層自組裝法及載體法。其中層層自組裝技術(shù)(Layer-by-Layer self-assemble technique, LbL)是應(yīng)用較多也較為成熟的方法。概括而言,就是在荷電的基材表面通過(guò)靜電相互作用,交替地吸附上帶相反電荷的聚電解質(zhì),形成自組裝多層聚電解質(zhì)復(fù)合物(polyelectrolyte complex, PEC)薄膜,也叫靜電自組裝。該技術(shù)由Decher G.等在20世紀(jì)90年代最先提出和應(yīng)用。LbL技術(shù)制備條件簡(jiǎn)單、溫和,不受基材形狀的限制,薄膜具有較高的熱力學(xué)穩(wěn)定性,可以控制涂層循環(huán)的次數(shù)達(dá)到控制涂層的量,并可以裝載細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)緩釋功能,然而層層自組裝是通過(guò)靜電作用實(shí)現(xiàn)的,由于RGD短肽分子量較小,所帶有的電荷很少,所以單純依靠自組裝來(lái)固定RGD,得到的種植體表面RGD量較少,有學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了改進(jìn)[30-31]。將層層自組裝引入到種植體表面RGD組裝方法中,并和化學(xué)偶聯(lián)相結(jié)合來(lái)組裝RGD,能明顯促進(jìn)RGD在種植體表面的結(jié)合力和數(shù)量,這是RGD在種植體表面組裝方法的重要進(jìn)展。 因人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞株為具有人成骨細(xì)胞表型特征的成骨細(xì)胞模型,因此本研究通過(guò)對(duì)比修飾前后的純鈦表面對(duì)人成骨肉瘤細(xì)胞MG63初期黏附增殖影響,對(duì)比鈦片經(jīng)噴砂與燒結(jié)兩種處理后,殼聚糖載體攜帶質(zhì)粒DNA在純鈦表面人成骨肉瘤細(xì)胞MG63中的轉(zhuǎn)染、表達(dá)效率差異。 目的： 1、利用鈦片模擬臨床種植體,探索新的種植體表面改性方法,在保證高種植成功率的同時(shí),縮短種植體與牙槽骨發(fā)生骨整合的時(shí)間,減輕患者的痛苦,獲得快速、有序、可控骨整合。 2、利用殼聚糖作為非病毒載體,在鈦片表面引入骨形態(tài)發(fā)生蛋白、細(xì)胞粘附短肽RGD,提高骨整合速度。 3、比較鈦片經(jīng)噴砂與燒結(jié)兩種處理后,其表面攜帶的hBMP-2cDNA基因在人成骨肉瘤細(xì)胞MG63內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率與表達(dá)差異。方法： 1、采用燒結(jié)和噴砂后進(jìn)行酸堿處理的方法對(duì)純鈦片表面進(jìn)行處理,并檢測(cè)其表征。 2、選擇hBMP-2cDNA作為活化因子,設(shè)計(jì)合成小分子靶向肽RGD短肽,選擇具有良好骨誘導(dǎo)性的生物大分子殼聚糖,將RGD(Arg-Gly-Asp)短肽與殼聚糖通過(guò)�；磻�(yīng)發(fā)生偶聯(lián)形成RGD/CS復(fù)合體,通過(guò)元素分析儀對(duì)復(fù)合體進(jìn)行元素含量檢測(cè),采用紅外光譜儀對(duì)RGD/CS復(fù)合體進(jìn)行驗(yàn)證。 3、采用復(fù)凝聚法制備RGD/CS/hBMP-2cDNA復(fù)合體,利用原子力顯微鏡對(duì)RGD/CS/hBMP-2cDNA復(fù)合體進(jìn)行表征檢測(cè)。 4、采用層層自組裝以及化學(xué)偶聯(lián)技術(shù)將RGD/CS/hBMP-2cDNA復(fù)合體接枝到事先處理好的鈦表面,對(duì)鈦表面采用EB染色檢驗(yàn)。 5、在接枝有RGD/CS/hBMP-2cDNA復(fù)合體的鈦片表面培養(yǎng)人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞,通過(guò)掃描電鏡檢測(cè)細(xì)胞在噴砂與燒結(jié)兩種不同處理鈦片表面生長(zhǎng)狀況；利用熒光顯微鏡觀察RGD/CS/hBMP-2cDNA復(fù)合體在MG-63細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率。 6、通過(guò)Real-Time PCR與Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同處理鈦片表面hBMP-2cDNA基因在MG-63細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1、紅外光譜分析表明,殼聚糖與RGD肽偶聯(lián)后的產(chǎn)物RGD/CS在1630cm-1附近的酰胺Ⅰ帶震動(dòng)顯著增加,表明偶聯(lián)過(guò)程中有大量碳氧雙鍵生成,證明殼聚糖和RGD肽成功偶聯(lián)；通過(guò)元素分析表明：在偶聯(lián)了RGD肽后,樣本IGD/CS的N原子含量比例,明顯較單純的殼聚糖為高,進(jìn)一步表明：殼聚糖接枝RGD成功。 2、酶切與電泳實(shí)驗(yàn)表明：]hBMP-2cDNA基因電泳條帶大小符合預(yù)期；質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果表明：載體構(gòu)建過(guò)程中,hBMP-2cDNA未發(fā)生基因突變,載體構(gòu)建成功。 3、電泳實(shí)驗(yàn)表明：RGD/CS/hBMP-2cDNA在N/P≥2時(shí),RGD/CS與hBMP-2cDNA質(zhì)粒完全復(fù)合；原子力顯微鏡檢測(cè)表明：N/P=2-50的RGD/CS/hBMP-2cDNA復(fù)合體粒徑為137-259nm,Zeta電位在+25mV～+30mV之間,且原子力顯微鏡結(jié)果表明復(fù)合物為類球形且分布良好。 4、純鈦片經(jīng)燒結(jié)處理后,經(jīng)掃描電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn),其表面均勻分布有“Ω”狀洞穴。 5、EB染色實(shí)驗(yàn)表明：接枝有RGD/CS/hBMP-2cDNA復(fù)合體的鈦片,能被EB染色,說(shuō)明RGD/C2/hBMP-2cDNA復(fù)合體接枝鈦片實(shí)驗(yàn)成功。 6、經(jīng)殼聚糖酶消化,鈦片表面接枝的RGD/CS/hBMP-2cDNA復(fù)合體釋放出的hBMP-2cDNA質(zhì)粒,經(jīng)測(cè)序表明：RGD/CS/hBMP-2cDNA復(fù)合體接枝鈦后hBMP-2cDNA基因序列穩(wěn)定性良好,未發(fā)生基因突變。 7、細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明：殼聚糖偶聯(lián)RGD后再包裹hBMP-2cDNA質(zhì)粒,其在人成骨肉瘤細(xì)胞MG63內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率明顯較單純的殼聚糖包裹hBMP-2cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率為高。 8、細(xì)胞掃描電鏡檢測(cè)表明：表面經(jīng)氧化性混酸溶液處理形成“Ω”狀的純鈦片,有利于細(xì)胞在其表面貼壁生長(zhǎng)；培養(yǎng)在接枝有RGD/CS/hBMP-2cDNA復(fù)合體的鈦片上的人成骨肉瘤細(xì)胞MG63,部分鑲嵌在“Ω”形狀的凹洞中,大大提高了細(xì)胞對(duì)鈦表面的吸附力。 9、熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)在接枝有RGD/CS/hBMP-2cDNA復(fù)合體的鈦片上的人成骨肉瘤細(xì)胞MG63,鈦表面BMP2質(zhì)粒能有效轉(zhuǎn)化到人成骨肉瘤細(xì)胞MG63內(nèi)。 10、Real-Time PCR與Western blotting實(shí)驗(yàn)表明：在接枝有RGD/CS/hBMP-2cDNA復(fù)合體的鈦片上的人成骨肉瘤細(xì)胞MG63內(nèi)超量表達(dá)了BMP2蛋白,且其表達(dá)量顯著高于培養(yǎng)在未經(jīng)修飾的鈦片上的人成骨肉瘤細(xì)胞MG63。 結(jié)論： 本研究表明：RGD能有效提高殼聚糖的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率；經(jīng)RGD短肽修飾的殼聚糖可以作為hBMP-2cDNA質(zhì)粒包裹載體；鈦表面hBMP-2cDNA表達(dá)載體能有效轉(zhuǎn)化到人成骨肉瘤細(xì)胞MG63內(nèi)；表面經(jīng)過(guò)RGD/CS/hBMP-2cDNA復(fù)合體修飾后的鈦種植體有利于人成骨肉瘤細(xì)胞MG63在其表面貼壁生長(zhǎng)并超量表達(dá)BMP2蛋白。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R783.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2266273