【摘要】：牙周炎(periodontal disease)是威脅人類口腔健康的常見病之一,是細菌及代謝產物介導的作用于牙周支持組織的具有慢性破壞性的疾病。牙周炎主要臨床表現為牙槽骨的吸收破壞,病理學變化顯示為骨新生的不足—骨生成與骨吸收失衡所致。由于牙周炎患病率高,與全身的健康密切相關,目前其臨床治療方式主要為對癥處理,控制牙周炎的繼續(xù)發(fā)展,對牙周炎所造成的骨質缺損尚無有效的治療措施,因此深入探索骨形成的機制對于牙周炎的防治具有極其重要的作用。骨平衡是一個動態(tài)變化過程,成骨細胞所引起的骨生成與破骨細胞所導致的骨吸收之間的平衡統(tǒng)一是維持骨代謝穩(wěn)態(tài)的關鍵。大量研究表明若骨形成少于骨吸收時,將導致如骨質疏松、牙周病、骨關節(jié)炎、風濕性關節(jié)炎等骨疾病;反之則導致骨硬化疾病。其中,成骨細胞為骨代謝平衡的主導因素之一,其活性可以被多種因素調節(jié)。因此骨生成的分子機制的研究對提高骨疾病所導致缺損的修復治療效果具有臨床意義。越來越多的研究都集中在成骨細胞的發(fā)生、增殖、分化中,這表明了在骨相關疾病中成骨細胞對骨再生的重要性�；谝陨戏治�,本研究擬通過成骨細胞分離培養(yǎng)及鑒定培養(yǎng)出實驗細胞,通過過表達核轉錄因子KLF4觀察其對成骨細胞增殖及分化相關基因的影響,從而探討KLF4對成骨細胞早期成骨分化的影響;最后本研究對成骨細胞分化過程中KLF4對骨平衡所涉及的基質分泌的影響,明確KLF4在成骨細胞成骨分化中發(fā)揮的作用,為牙周疾病臨床診治進一步提出理論依據。方法:1.利用分段酶消化法從新生小鼠顱骨片中獲得成骨原代細胞,顯微鏡下觀察細胞形態(tài),經成骨誘導液分別培養(yǎng)9 d和21 d后采取ALP染色和茜素紅染色對其進行鑒定。2.采用免疫熒光技術檢測成骨細胞中KLF4的表達;成功構建攜帶KLF4的重組腺病毒載體(Ad-KLF4),成骨細胞經不同感染復數(multiplicity of infection,MOI)的Ad-KLF4轉染后熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光表達情況并檢測轉染效率。將成骨細胞隨機分為對照組(未轉染組)、KLF4組(Ad-KLF4轉染)和GFP組(Ad-GFP轉染),經最佳MOI感染后MTT測定細胞增殖,Real-time PCR檢測成骨相關基因堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、核心蛋白結合因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)的表達。3.采用western-blot檢測成骨細胞成骨分化過程KLF4,MMP2及COL1的表達;siRNA KLF4或者Ad-KLF4處理成骨細胞后,在成骨細胞及成骨細胞早期分化過程(0d、2 d、4 d)通過wester-blot及Real-timePCR觀察其對MMP2及COL1蛋白及基因表達的影響;結果:1.本實驗利用酶消化法從新生小鼠顱骨片中獲得細胞形態(tài)呈多邊形、立方形的成骨原代細胞。ALP染色可見細胞漿內大量沙礫狀藍染陽性顆粒,茜素紅染色可見呈細胞外成片紅色礦化團塊。通過細胞形態(tài)學的觀察以及染色鑒定表明通過分段酶消化法可以分離培養(yǎng)出成骨原代細胞,為本實驗的進一步順利進行打下基礎。2.經PCR擴增、基因測序成功構建出攜帶KLF4基因的重組腺病毒載體(Ad-KLF4)。成骨細胞經最適合MOI(100 PFU/ml)處理后,KLF4組可觀察到KLF4蛋白及mRNA水平顯著上升;成骨細胞增殖速率明顯上升;成骨分化相關基因ALP、RUNX2、BSP的水平顯著下降。3.隨著成骨細胞成骨分化時間的延長,KLF4的表達不斷上升,伴隨著MMP2表達下降及COL1表達的升高。經40NM的KLF4 siRNA感染后,KLF4基因及蛋白表達明顯下降,同時MMP2的表達上升,COL1的表達下降;經MOI=100 PFU/ml的Ad-KLF4感染后,KLF4表達水平顯著上升,相反MMP2表達下調,COL1的基因及蛋白水平依然呈下降趨勢。結論:1.本實驗利用分段酶消化法成功獲得成骨原代細胞,且第二代細胞生長狀態(tài)好、活力好,能滿足后續(xù)實驗要求。2.Ad-KLF4轉染成骨細胞后可使成骨細胞增殖速率增加,下調成骨分化基因ALP、BSP、RUNX2水平,最終抑制骨形成。3.在骨平衡中,KLF4可以負性調控成骨細胞中MMP2的表達,調控骨形成過程中基質的分泌,從而影響骨形成。
[Abstract]:Periodontitis is one of the common diseases threatening human oral health, and is a chronic and destructive disease mediated by bacteria and metabolites in periodontal support tissues. The main clinical manifestations of periodontitis are absorption and destruction of alveolar bone, and pathological changes show that the deficiency of bone regeneration is caused by imbalance of bone resorption and bone resorption. Because the prevalence of periodontitis is high, it is closely related to the health of the whole body, the current clinical treatment way is mainly symptomatic treatment, the continuous development of periodontitis is controlled, and no effective treatment measures are available for the bone defect caused by periodontitis, Therefore, deeply exploring the mechanism of bone formation plays an extremely important role in the prevention and treatment of periodontitis. Bone balance is a dynamic process, and the balance between bone resorption caused by osteoblasts and bone resorption caused by osteoclasts is the key to maintaining the homeostasis of bone metabolism. A large number of studies have shown that if bone formation is less than bone resorption, bone diseases such as osteoporosis, periodontal disease, osteoarthritis, rheumatic arthritis, and the like are caused; conversely, bone-hardening disease is caused. Among them, osteoblasts are one of the leading factors of bone metabolism balance, and their activity can be regulated by a variety of factors. Therefore, the study of molecular mechanism of bone formation is of clinical significance to improve the curative effect of repairing the defect caused by bone disease. More and more studies have focused on the occurrence, proliferation and differentiation of osteoblasts, indicating the importance of osteoblasts to bone regeneration in bone-related diseases. Based on the above analysis, this study intends to investigate the effects of KLF4 on osteoblast proliferation and differentiation related genes through the isolation and culture of osteoblasts and the identification and culture of experimental cells, and to investigate the effect of KLF4 on the early bone differentiation of osteoblasts by observing the effect of KLF4 on the proliferation and differentiation of osteoblasts. Finally, the effect of KLF4 on the bone balance in osteoblast differentiation was studied, and the role of KLF4 in osteoblast differentiation was defined, and further theoretical basis was put forward for clinical diagnosis and treatment of periodontal disease. Method: 1. Bone primary cells were obtained from the skull tablets of newborn mice by a segmented enzymatic digestion method. The morphology of the cells was observed under a microscope. ALP staining and scarlet staining were performed after 9 days and 21 days respectively after being cultured for 9 days and 21 days, respectively. The expression of KLF4 in osteoblasts was detected by immunofluorescence; the recombinant adenovirus vector (Ad-KLF4) carrying KLF4 was successfully constructed. The cell green fluorescence was observed under fluorescence microscope after Ad-KLF4 transfected with multiple infection (MOI), and transfection efficiency was detected. Osteoblasts were randomly divided into control group (non-transfected group), KLF4 group (Ad-KLF4 transfection) and GFP group (Ad-GFP transfection). After the best MOI infection, cell proliferation and real-time PCR were detected as bone-related gene alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP). Expression of core protein binding factor 2 (RUNX2). The expression of KLF4, MMP2 and COL1 was detected by western-blot. After treatment of osteoblasts with siRNA KLF4 or Ad-KLF4, the effects of MMP2 and COL1 protein and gene expression were observed through wester-blot and Real-time PCR in the early differentiation of osteoblasts and osteoblasts (0d, 2d, 4d). In this experiment, the cell morphology was polygonal in the skull tablet of newborn mice by the enzyme digestion method. In the ALP staining, a large amount of sand-like blue-stained positive particles were observed in the cytoplasm of the cells, and the red-stained red-stained clusters of red cells in the cytoplasm of the cells were observed. Through the observation of cell morphology and the identification of staining, it is shown that the culture of primary cells can be separated by segmented enzymatic digestion, which will lay the foundation for the further progress of this experiment. The recombinant adenovirus vector (Ad-KLF4) carrying the KLF4 gene was successfully constructed by PCR amplification and gene sequencing. After treatment with MOI (100 PFU/ ml), the level of KLF4 protein and mRNA increased significantly in KLF4 group, and the rate of osteoblast proliferation increased significantly. With the prolongation of osteoblast differentiation time, the expression of KLF4 increased continuously with the decrease of MMP2 expression and the increase of COL1 expression. After the infection of KLF4 siRNA of 40NM, the expression of KLF4 gene and protein decreased obviously, while the expression of MMP2 increased and the expression of COL1 decreased. After the infection of Ad-KLF4 infected with MOI = 100 PFU/ ml, the expression level of KLF4 increased significantly, while the expression of MMP2 was down-regulated, and the gene and protein level of COL1 continued to decrease. Conclusion: 1. In this experiment, the bone primary cells were successfully obtained by the method of segmented enzyme digestion, and the second generation cells were good in growth state and good in activity, which could meet the follow-up experimental requirements. The proliferation rate of osteoblasts was increased after the transfection of osteoblasts with Ad-KLF4, and the ALP, BSP and RUNX2 levels of the bone-differentiated genes were down-regulated. Final inhibition of bone formation. 3. In bone balance, KLF4 can regulate the expression of MMP2 in osteoblasts and regulate the secretion of matrix during bone formation, thus affecting bone formation.
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R781.4

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 儲誠兵,陳藝新,尹培榮,陳雄德;胰島素樣生長因子-1與成骨細胞[J];中國矯形外科雜志;2001年03期

2 于明香,王洪復;成骨細胞的增齡性改變[J];中華老年醫(yī)學雜志;2003年06期

3 李紫晶,吳劍波;作用于成骨細胞的生物活性物質及化合物[J];國外醫(yī)藥(抗生素分冊);2003年02期

4 周愛國,安洪;離體時間對成骨細胞活性影響研究[J];現代醫(yī)藥衛(wèi)生;2003年06期

5 史風雷,王海彬,楊勇,楊榮建;成骨細胞與破骨細胞的共培養(yǎng)體系[J];中醫(yī)正骨;2003年10期

6 王稚英,王興,肖軍軍,董曉敏,孟書聰,趙曼;連續(xù)植塊培養(yǎng)原代成骨細胞及其特性的比較[J];北京大學學報(醫(yī)學版);2004年01期

7 郭若霖,賈雷鳴,溫學紅,程瑞芳,胡永成,張福江,談志龍,王學謙;骨髓間充質干細胞經不同時間成骨細胞誘導后細胞性質比較[J];基礎醫(yī)學與臨床;2005年09期

8 姜華,王稚英,姚琦,劉洪臣,張立海;缺氧誘導成骨細胞VEGF的表達及其對成骨細胞分化的影響[J];口腔醫(yī)學研究;2005年01期

9 薛燕濰,李鋒杰,王亦進,薛建生;成骨細胞培養(yǎng)方法的改良[J];解剖科學進展;2005年01期

10 漆海如;黃永明;劉金文;許少健;;中醫(yī)藥對成骨細胞作用的研究進展[J];中醫(yī)正骨;2006年01期

相關會議論文 前10條

1 劉琴麗;孫樹津;霍波;龍勉;;成骨細胞鋪展形狀和面積對其凋亡的影響[A];第九屆全國生物力學學術會議論文匯編[C];2009年

2 郭海玲;趙詠芳;王翔;徐宇;段鐵驪;詹紅生;;人內皮細胞與成骨細胞共育系的建立及細胞功能的實驗研究[A];中華醫(yī)學會第三次骨質疏松和骨礦鹽疾病中青年學術會議論文匯編[C];2011年

3 張克勤;李振華;Jenifer Rosser;Lynda;F．Bonewald;;成骨細胞向骨細胞分化后可能表達多種新蛋白[A];中華醫(yī)學會第四次全國骨質疏松和骨礦鹽疾病學術會議論文匯編[C];2006年

4 馮建國;崔瀚威;劉歡;唐麗靈;;過載拉伸刺激下成骨細胞功能基因的變化[A];第十屆全國生物力學學術會議暨第十二屆全國生物流變學學術會議論文摘要匯編[C];2012年

5 尹文哲;陶天遵;陶樹清;;大鼠成骨細胞與破骨細胞共育的實驗研究[A];第二屆海峽兩岸矯形外科學術研討會論文集[C];2004年

6 金慰芳;朱文菁;王洪復;;培養(yǎng)成骨細胞衰老的超微結構改變[A];骨質疏松研究與防治第二卷——第四屆全國骨質疏松學術研討會論文集[C];1996年

7 何銀鋒;徐又佳;;不同濃度鐵離子對成骨細胞鐵離子通道蛋白的影響[A];中華醫(yī)學會第五次中青年骨質疏松和骨礦鹽疾病學術會議論文集[C];2013年

8 李瑩輝;丁柏;汪恭質;聶捷琳;畢蕾;;空間環(huán)境因素及藥物對成骨細胞影響作用的初步研究[A];西部大開發(fā) 科教先行與可持續(xù)發(fā)展——中國科協(xié)2000年學術年會文集[C];2000年

9 矯黎東;秦書儉;;人工培養(yǎng)成骨細胞在兔橈骨缺損區(qū)的成骨作用[A];解剖學雜志——中國解剖學會2002年年會文摘匯編[C];2002年

10 張西正;李彬;郭勇;吳金輝;;基底應變作用下成骨細胞活性與功能的研究[A];中國生物醫(yī)學工程學會第六次會員代表大會暨學術會議論文摘要匯編[C];2004年

相關重要報紙文章 前10條

1 楊麗佳邋通訊員 周寧人;骨折不愈合緣于成骨細胞“爬不動”[N];健康報;2008年

2 楊麗佳邋周寧人;骨折不愈合 緣于成骨細胞“爬不動”[N];大眾衛(wèi)生報;2008年

3 楊建輝;雌三醇對成骨細胞保護作用的研究[N];中國中醫(yī)藥報;2004年

4 錢錚;日本利用人類胎盤培育出成骨細胞[N];中國勞動保障報;2006年

5 錢錚;日本利用人類胎盤培育出成骨細胞[N];醫(yī)藥經濟報;2006年

6 編譯 紫箕;2010年獲批的小分子藥物[N];醫(yī)藥經濟報;2011年

7 姜瀾;特立帕肽：促進骨形成 降低骨折發(fā)生風險[N];中國醫(yī)藥報;2011年

8 殼寡糖與人類未來健康工程專家委員會委員 宋志蘭;關愛骨關節(jié)[N];保健時報;2010年

9 王婷 張金超 楊夢u& 肖培根;頗具潛力的抗骨質疏松癥中藥[N];中國醫(yī)藥報;2006年

10 崔寧 王燕 薛佳;關注骨關節(jié)健康 防治骨關節(jié)病[N];保健時報;2009年

相關博士學位論文 前10條

1 董鑫;共培養(yǎng)條件下脂肪細胞脂毒性對成骨細胞影響的機制研究[D];第四軍醫(yī)大學;2014年

2 耿彬;ERK5信號通路在成骨細胞凋亡以及小鼠骨質疏松癥發(fā)生中的作用[D];蘭州大學;2016年

3 佟雁翔;力生長因子通過PI3K/AKT途徑促進兔骨髓基質干細胞增殖及其向成骨細胞的分化[D];重慶醫(yī)科大學;2015年

4 李明靜;高遷移率族蛋白B1對成骨細胞遷移和增殖的影響及其作用機制[D];南方醫(yī)科大學;2016年

5 朱冬冬;高糖對內皮—成骨細胞轉分化的影響及機制探討[D];東南大學;2016年

6 孫官文;低氧誘導因子-1α誘導的MG-63成骨細胞的凋亡分子機制研究[D];武漢大學;2015年

7 鄭俊;Shp2成骨細胞靶向特定敲除小鼠動物模型的建立及其臨床表型分析及致病機理研究[D];武漢大學;2014年

8 黃弘;利用成骨細胞特異性敲除小鼠研究C/EBPα在骨發(fā)育中的作用[D];重慶醫(yī)科大學;2017年

9 徐凌;成骨生長肽對成骨細胞和骨髓基質細胞增殖分化影響的研究[D];四川大學;2006年

10 黃湛;一氧化氮對小鼠成骨細胞的生長和礦化調控[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2006年

相關碩士學位論文 前10條

1 楊佳佳;KLF4對小鼠成骨細胞成骨分化及基質分泌的影響[D];第三軍醫(yī)大學;2017年

2 王川;紅景天苷調控大鼠顱骨成骨細胞表型表達及相關機制的研究[D];河北聯合大學;2014年

3 辛瑩;內質網應激介導棕櫚酸誘導的成骨細胞凋亡[D];鄭州大學;2015年

4 曹魯寧;IL-17F對大鼠成骨細胞BMP-2及Noggin mRNA表達的影響[D];山東大學;2015年

5 張文麗;流體剪切力對SD大鼠髁突與脛骨軟骨下骨成骨細胞作用的比較研究[D];昆明醫(yī)科大學;2015年

6 韓雨晨;Rho/ROCK通路對應力調控成骨細胞Cofilin及成骨相關基因表達作用的研究[D];第四軍醫(yī)大學;2015年

7 王健;鎂離子對成骨細胞生物學行為的促進作用及其機制研究[D];第四軍醫(yī)大學;2015年

8 任原;缺氧對多孔鉭-人成骨細胞復合物細胞增殖、分泌功能及成骨基因表達的影響[D];華北理工大學;2015年

9 張杰;雞TRPV6 RNA干擾質粒的構建及其對成骨細胞鈣轉運基因表達的影響[D];南京農業(yè)大學;2014年

10 李濟伶;miR-335-5p對高糖狀態(tài)下成骨細胞功能的影響[D];重慶醫(yī)科大學;2015年

，

本文編號：2256553